[發明專利]真核微生物抗苯菌靈標記突變株的選育方法

在審

• 申請號: 201610028320.7
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105543212A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 趙喜華;易拾;涂宗財
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于誘變育種中篩選標記選育領域，涉及真核微生物經紫外誘 變產生抗苯菌靈突變株的誘變方法。

背景技術

真核微生物代謝產物已廣泛應用于我們生活和生產中，為了進一步提 高其產量，獲得具有抗性標記突變株是選育高產突變株的關鍵。

研究表明，原始真核微生物是不具有抗苯菌靈的特性，同時原始真核 微生物生產代謝產物的水平普遍偏低，而基因組重排是真核微生物改造的主要方 法，但是首要條件是要獲得具有抗苯菌靈標記的出發菌株。

發明內容

為了克服現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種基于紫外誘變 技術用于篩選抗苯菌靈突變株的方法，對比其它物理和化學誘變方法，本發明方 法簡便實用，特別適用于青霉屬等真核微生物抗苯菌靈標記的篩選。

本發明提出了一種真核微生物抗苯菌靈標記突變株的選育方法，所述 紫外誘變程序：

距紫外線距離，10-30cm；

誘變時間，40-120s；

本發明還提出了一種真核微生物抗苯菌靈標記突變株的選育方法，其 特征在于孢子制備、初篩和復篩，所述方法包括以下步驟：

步驟一、真核微生物孢子菌懸液的制備，其包括：將真核微生物接 種于PDA培養基中28℃培養5-7天，用50mL去離子水洗脫孢子，將孢子放入 裝有已滅菌玻璃珠的三角瓶中，于200rpm、28℃搖20min，再用已滅菌的含有 棉花的漏斗過濾除去菌絲體和培養基，獲得單孢子懸浮液；

步驟二、將獲得的單孢子懸浮液距紫外線距離10-30cm，誘變時間為 40-120s獲得突變株；

步驟三、取100μL的稀釋菌液涂布于初篩選培養基(含50μg/mL苯菌 靈)上，初篩獲得抗苯菌靈的突變株；

步驟四、將步驟三獲得的突變株傳接3代于含有50μg/mL苯菌靈的 初篩培養基上，防止回復突變。

本發明在上述整個操作過程中，可以一次獲得含有抗苯菌靈的突變 株，大大降低以往反復繁重的篩選強度；

綜上所述，本發明提供了真核微生物抗苯菌靈的誘變方法，為真核微 生物抗性誘變提供了快捷適用的技術。

具體實施方式

通過以下具體實施例，對本發明作詳細說明，本發明的保護內容不 局限于以下實施例。本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中， 并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方 法等，除本領域的普遍知識和公知常識外，本發明沒有特別限制內容。

1、草酸青霉16孢子的紫外誘變程序：

距紫外線距離，20cm；

誘變時間，60s。

2、草酸青霉16抗苯菌靈標記突變株的選育方法，所述方法包括以下 步驟：

草酸青霉16孢子菌懸液的制備，其包括：將草酸青霉16接種于PDA 培養基中28℃培養7天，用50mL去離子水洗脫孢子，將孢子放入裝有已滅菌 玻璃珠的三角瓶中，于200rpm、28℃搖20min，再用已滅菌的含有棉花的漏斗 過濾除去菌絲體和培養基，獲得單孢子懸浮液；

用上述草酸青霉16孢子的紫外誘變程序處理單孢子懸浮液獲得突 變株；

取100μL的稀釋菌液涂布于初篩選培養基(含50μg/mL苯菌靈)上， 初篩獲得抗苯菌靈的突變株；

初篩培養基：1-2％溶脹纖維素，0.3％KH₂PO₄，0.2％(NH₄)₂SO₄， 0.05％尿素，0.05％MgSO₄，0.05％CaCl₂，1‰(v/v)孟德爾鹽溶液，50μg/mL 苯菌靈，1.6-2％瓊脂粉，根據水解圈大小來篩選；

復篩并驗證抗苯菌靈突變株，將初篩的突變株接種于復篩培養基中， 每個突變株復篩3次，防止回復突變；

復篩培養基包括：1-2％溶脹纖維素，0.3％KH₂PO₄，0.2％(NH₄)₂SO₄， 0.05％尿素，0.05％MgSO₄，0.05％CaCl₂，1‰(v/v)孟德爾鹽溶液，50μg/mL 苯菌靈，通過DNS方法測定酶活。