[發明專利]過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及構建

有效

• 申請號: 201610028141.3
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105624176B
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 何寧;陳震;王志;王遠鵬;李清彪;沈亮
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/75;C12P19/04;C02F3/34;C02F101/20;C02F101/30
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及構建，屬于基因工程及微生物發酵技術領域。克隆了多糖絮凝劑合成途徑的關鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，利用大腸桿菌－芽孢桿菌穿梭質粒構建重組表達載體。通過電轉化的方法將重組質粒導入到地衣芽孢桿菌，構建了重組地衣芽孢桿菌HN301?2，構建的重組地衣芽孢桿菌比出發菌株的多糖絮凝劑產量提高了15.6％，發酵液絮凝活性提高了70％。可望用于多糖絮凝劑的工業化生產，提高產量，降低成本。

技術領域

本發明屬于基因工程及微生物發酵技術領域，具體是涉及一株過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌及其構建方法。

背景技術

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase)在植物、動物和細菌中廣泛分布，是一種與糖代謝密切相關的酶。它催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作為葡萄糖基的供體，在細胞內作為蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、果膠質以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多種碳水化合物的前體。已有研究表明尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB)是多糖生物合成的關鍵酶基因(Journal of Bacteriology,176(9):2611-2618；Biochemical Journal,370(1):995-1001)。

微生物絮凝劑(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能夠使懸浮液中的固體顆粒、菌體、細胞和膠狀物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白質、纖維素和DNA等。微生物絮凝劑具有安全、高效、可生物降解和對環境無污染等優勢，且能產生絮凝劑的微生物種類多、生長快、易于采用工程手段而實現產業化。因此微生物絮凝劑的開發前景十分看好。目前，多糖生物絮凝劑已經應用于去除紡織印染廢水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，還可以去除工業廢水中的重金屬離子和其它懸浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝劑產量低、成本較高，制約著它的大規模工業化應用。目前，對于培養基、培養條件、生長因子等外部因素影響多糖絮凝劑合成的報道已經很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而從地衣芽孢桿菌的遺傳及生理學角度對其多糖絮凝劑合成量影響的報道甚是少見。由于多糖絮凝劑結構復雜，且大多數針對多糖的研究并不關注絮凝活性，所以有關多糖絮凝劑代謝途徑的研究還較少，而通過分子生物學技術改造菌株提高多糖絮凝劑產量的報道幾乎沒有。因此通過基因工程技術構建高產優良菌株，進一步提高多糖絮凝劑活性及產量，具有重要的經濟價值及社會意義。

本申請人在中國專利CN101503709中公開利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方法，其中，微生物地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中多糖絮凝劑絮凝活性不高、調控機理不明等問題，提供一株過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB)的地衣芽孢桿菌基因工程菌及其構建方法。

所述過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(gtaB)是編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，也是合成多糖絮凝劑的必需前體，基于以上理論分析，過表達gtaB基因，能夠增大多糖絮凝劑合成途徑的代謝流量，有利于提高多糖絮凝劑的產量，降低成本。

利用PCR擴增克隆多糖絮凝劑合成途徑的關鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB。