[發明專利]過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及構建

有效

• 申請號: 201610028141.3
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105624176B
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 何寧;陳震;王志;王遠鵬;李清彪;沈亮
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/75;C12P19/04;C02F3/34;C02F101/20;C02F101/30
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于是地衣芽孢桿菌中編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，命名為gtaB，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.過表達權利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌的制備方法，其特征在于其具體步驟如下：

將權利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因插入到表達載體上，然后利用電轉化的方法導入到地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中，通過抗性篩選獲得目的基因的工程菌，即過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌；所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876。

3.如權利要求2所述方法，其特征在于所述表達載體為pHY300PLK-PamyL-TTamyL，所述表達載體的啟動子為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的啟動子PamyL。

4.如權利要求2所述方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)設計PCR引物擴增所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB；

(2)將擴增得到的目的基因插入到pHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動子PamyL下游多克隆位點，得到pHY300-gtaB過表達質粒；

(3)然后將pHY300-gtaB過表達質粒導入到E.coli DH5α中，以備擴增后電轉化；

(4)將經提取、濃縮后的pHY300-gtaB過表達質粒電轉化所述地衣芽孢桿菌CGMCCNo.2876，37℃復蘇5h后，涂布四環素抗性平板，再在37℃培養12h，篩選轉化子；

(5)轉化子經質粒提取后，利用PCR和雙酶切進行驗證，從而獲得過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌。

5.如權利要求2所述方法制備的過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌在制備多糖絮凝劑中應用。

6.如權利要求5所述應用，其特征在于所述多糖絮凝劑的制備方法包括以下步驟：

(1)刮一環地衣芽孢桿菌基因工程菌接種于液體種子培養基中培養，得種子培養液；所述培養的條件為：35～37℃，200r/min培養12～16h；

(2)按體積百分比以4％的接種量接種于多糖絮凝劑發酵培養基中培養，得發酵液；所述培養的條件為：在30～40℃，150～300r/min條件下培養50～60h；

(3)將發酵液離心收集上清液，再用乙醇提取，所得提取液冷凍真空干燥后即得多糖絮凝劑。

7.如權利要求6所述應用，其特征在于在步驟(2)中，所述培養的條件為：在37℃，200r/min的條件下培養48～56h。

8.如權利要求6所述應用，其特征在于在步驟(3)中，所述乙醇與上清液的體積比為3∶1；所述提取的條件為：離心的速度為6000～8000rpm，離心的時間為10～15min，離心的溫度為4℃。