[發明專利]一種石油降解菌劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201610027788.4
• 申請日: 2016-01-09
• 公開（公告）號: CN105483058B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 趙升;韓龍江;耿曉;潘玉龍;劉欣禹;周瑞佳
• 申請（專利權）人: 國家海洋局北海環境監測中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/16;B09C1/10;C12R1/72;C12R1/06;C12R1/01;C12R1/645
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1.一種石油降解菌劑的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)將惰性柄桿菌(Caulobacter segnis)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、抗酚小短桿菌(Brachybacterium phenoliresistens)、球形節桿菌(Arthrobacterglobiformis)以及鮭色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus salmonicolor)菌種分別進行擴大培養至菌體濃度為10⁹～10¹⁰cfu/g，將惰性柄桿菌、近平滑假絲酵母、抗酚小短桿菌、球形節桿菌以及鮭色鎖擲孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的質量比混合均勻，得混合菌種；

(2)將液體發酵培養基高壓滅菌15-30min，在無菌操作臺中，向滅菌處理的液體發酵培養基中接種步驟(1)所得的混合菌種，混合菌種與液體發酵培養基的重量比為1∶(10-15)，將接種了混合菌種的液體發酵培養基置于恒溫水浴搖床，在140rpm、27-30℃條件下連續發酵48-60小時；

(3)用酵母分離離心機離心分離除去發酵液中的水，把離心獲得的粘稠狀菌體充分攪拌以混合均勻，獲得粘稠狀菌體細胞；

(4)向步驟(3)所得的粘稠狀菌體細胞中加入滅菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均勻，得菌體混合溶液，所述0.9％NaCl溶液與粘稠狀菌體細胞的重量比為1∶(20-40)，所述海泥浸出液與粘稠狀菌體細胞的重量比為1∶(0.5-0.8)；

(5)稱取重量份數為15-20份的糯稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石榴皮，將稱量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均勻，將混合物高壓滅菌15-30min，將滅菌后的混合物和步驟(4)所得的菌體混合溶液按照1∶2的重量比混合均勻；于37℃恒溫培養2-5天，得到固體菌劑并在4℃條件下密封保存；

所述惰性柄桿菌(Caulobacter segnis)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC菌種編號NO.4.1475；

所述近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC菌種編號為NO.1693；

所述抗酚小短桿菌(Brachybacterium phenoliresistens)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC菌種編號為NO.23825；

所述球形節桿菌，拉丁學名Arthrobacter globiformis，屬于細菌界Bacteria，放線菌門Actinobacteria，放線菌綱Actinobacteria，放線菌目Actinomycetales，微球菌科Micrococcaceae，節細菌屬Arthrobacter；

所述鮭色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus salmonicolor)，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC菌種編號為NO.31636；

所述液體發酵培養基的配方如下：1L的液體發酵培養基中含有5-8g的酵母粉、5-8g麥麩、16-20g蛋白胨、4-6g葡萄糖、8-12g玉米淀粉、0.6-1g貝殼粉、0.5-0.9g膨潤土、0.8-1.2g的MgSO₄·7H₂O、0.3-0.6g的Na₂HPO₄、0.1-0.3g磷酸二氫鉀、余量的去離子水定容至1L；

所述海泥浸出液的制備方法為：將海泥用粉碎機粉碎，過150目篩，過篩后加入提取罐中，將質量濃度為50％的酒精加入提取罐中，酒精用量為海泥重量的15倍，開啟攪拌，將提取罐置于恒溫水浴搖床，在140rpm、70-80℃條件下提取30min，100目過濾取濾液，濾渣返回提取罐中重復提取一次，100目過濾取濾液，合并兩次所得濾液，得海泥浸出液。

2.根據權利要求1所述的石油降解菌劑的制備方法，其特征在于：步驟(2)中的發酵溫度為28℃。

3.根據權利要求1所述的石油降解菌劑的制備方法，其特征在于：步驟(4)中，所述0.9％NaCl溶液與粘稠狀菌體細胞的重量比為1∶30。

4.根據權利要求1所述的石油降解菌劑的制備方法，其特征在于：步驟(4)中，海泥浸出液與粘稠狀菌體細胞的重量比為1∶0.6。