[發(fā)明專利]一種永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610027460.2
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105483089A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張彥明;崔紅杰;郭抗抗
• 申請（專利權(quán)）人: 張彥明
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種永生化仔豬口腔黏膜上 皮細胞系及其建立方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

口腔黏膜上皮細胞作為哺乳動物免疫系統(tǒng)的第一道防線，是細菌病毒感染 宿主遇到的最早的一類細胞。口腔黏膜上皮細胞能夠像髓系細胞一樣產(chǎn)生免疫 反應(yīng)，在識別微生物抗原方面具有重要作用。口腔黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)存在 很大的困難，取材不易，費時費力，傳代次數(shù)有限，細胞穩(wěn)定性、均一性很差， 許多實驗結(jié)果因細胞培養(yǎng)代數(shù)的不同而沒有可比性，極大地限制了其研究和應(yīng) 用。因此，建立一株穩(wěn)定的口腔黏膜上皮細胞系，為相關(guān)疾病致病機理及疫苗 等的研究提供良好的細胞模型，具有重大的意義。西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學 院張彥明教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊已經(jīng)先后成功建立了永生化豬臍靜脈血管內(nèi)皮細 胞系、豬小腸黏膜上皮細胞系等，具有建立永生化細胞系的成熟技術(shù)。本發(fā)明 創(chuàng)建了仔豬口腔黏膜上皮細胞的分離與培養(yǎng)方法，并通過轉(zhuǎn)染將真核表達質(zhì)粒 PCI-neo-hTERT導(dǎo)入原代豬口腔黏膜上皮細胞，經(jīng)過G418抗性篩選獲得陽性克 隆細胞，進一步篩選克隆化細胞，獲得永生化的仔豬口腔黏膜上皮細胞系，為 研究口蹄疫病毒、豬水泡病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的入侵、復(fù)制、致 病等機理提供一個可供選擇的細胞模型，并為相關(guān)病原疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ) 材料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方 法，旨在解決豬口腔黏膜上皮原代細胞體外培養(yǎng)傳代次數(shù)有限，細胞穩(wěn)定性、 均一性差的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法， 所述永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法包括：

原代培養(yǎng)仔豬口腔黏膜上皮細胞；

將含有hTERT基因的真核表達質(zhì)粒pCI-neo-hTERT，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo) 入原代培養(yǎng)的仔豬口腔黏膜上皮細胞；

轉(zhuǎn)染細胞24h后給細胞換液，48h后加含500μg/mLG418的DMEM/F12培 養(yǎng)基篩選；

高倍鏡下標記陽性克隆，套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽性克隆， 轉(zhuǎn)入另外培養(yǎng)板培養(yǎng)；

擴大培養(yǎng)：用含250μg/mLG418的培養(yǎng)基繼續(xù)篩選培養(yǎng)一個月，得到抗 G418穩(wěn)轉(zhuǎn)陽性細胞；

篩選1個月后，培養(yǎng)基中不再添加G418，繼續(xù)培養(yǎng)超過50代次的細胞即 是永生化的細胞系，永生化的細胞與原代細胞形態(tài)一致。

進一步，所述原代培養(yǎng)仔豬口腔黏膜上皮細胞具體包括：

將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死，酒精消毒，剪取面頰部位對應(yīng)的 口腔上皮組織，無菌條件下PBS(含600IU/ml雙抗，5μg/mL的兩性霉素B) 漂洗數(shù)遍，4℃浸泡30min，將口腔上皮組織剪成＜1mm³的糜狀，PBS漂洗3 遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養(yǎng)板，靜置10min，加入原代培養(yǎng)用 生長液，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h觀察有無細菌污染，每 3d換一次液，每日觀察細胞形態(tài)及生長情況，培養(yǎng)7～12d。

進一步，所述將pCI-neo-hTERT轉(zhuǎn)染導(dǎo)入原代培養(yǎng)的仔豬口腔上皮細胞具 體包括：

轉(zhuǎn)染前48h，0.25％胰酶消化原代豬口腔黏膜上皮細胞并計數(shù)，以1×10⁴個 細胞/孔接種到12孔板內(nèi)，使細胞在轉(zhuǎn)染當天能達到80％～90％的匯合度；

用無血清Opti-mem培養(yǎng)液分別稀釋2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT 質(zhì)粒至體積為50μL，使質(zhì)粒濃度達到0.01μg/μL～0.04μg/μL，輕輕混勻，室溫 作用5min；

用無血清Opti-mem培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine3000TransfectionReagent4 μL至體積為50μL，輕輕混勻，室溫作用5min；

混合稀釋的質(zhì)粒和稀釋的Lipofectamine3000，此時總體積為100μL，輕輕 混勻，室溫作用20min；

逐滴將所得混合物加入到不同孔中，邊加邊搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻；同時 設(shè)立2孔未轉(zhuǎn)染空白對照；

于37℃、5％的CO₂培養(yǎng)箱中48h后，加入含500μg/mLG418的DMEM/F12 培養(yǎng)基進行篩選。