[發明專利]一種永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法和應用

在審

• 申請號: 201610027460.2
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105483089A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 張彥明;崔紅杰;郭抗抗
• 申請（專利權）人: 張彥明
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在于，所述永生 化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法包括：

原代培養豬口腔黏膜上皮細胞；

提取純化含有hTERT基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT，采用脂質體轉 染法，將質粒導入原代培養的仔豬口腔黏膜上皮細胞；

真核表達質粒pCI-neo-hTERT轉染細胞24h后給細胞換液，48h后加含500 μg/mLG418的DMEM/F12培養基篩選；

高倍鏡下標記陽性克隆，套環法或刮除法結合有限稀釋法篩選陽性克隆， 轉入另外培養板培養；

擴大培養：用含250μg/mLG418的培養基繼續篩選培養一個月，得到抗 G418穩轉陽性細胞；

篩選1個月后，培養基中不再添加G418，繼續培養超過50代次的細胞即 是永生化的細胞系，永生化的細胞呈現典型的鋪路石狀，與原代細胞形態一致。

2.如權利要求1所述的永生化豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在 于，所述原代培養仔豬口腔黏膜上皮細胞具體包括：

將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死。酒精消毒，剪取面頰部位對應的 口腔上皮組織，無菌條件下PBS(含600IU/ml雙抗，5μg/mL的兩性霉素B) 漂洗數遍，4℃浸泡30min，將口腔上皮組織剪成＜1mm³的糜狀，PBS漂洗3 遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養板，靜置10min，加入原代培養用 生長液，置于37℃、5％CO₂培養箱中進行培養，24h觀察有無細菌污染，每 3d換一次液，每日觀察細胞形態及生長情況，培養7～12d。

3.如權利要求1所述的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征 在于，所述將pCI-neo-hTERT轉染導入原代培養的仔豬口腔黏膜上皮細胞具體 包括：

轉染前48h，0.25％胰酶消化原代仔豬口腔黏膜上皮細胞并計數，以每孔 1×10⁴個細胞接種到12孔板內，使細胞在轉染當天能達到80％～90％的匯合度；

用無血清Opti-mem培養液分別稀釋2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT 質粒至體積為50μL，使質粒濃度達到0.01μg/μL～0.04μg/μL，輕輕混勻，室溫 作用5min；

用無血清Opti-mem培養液稀釋Lipofectamine3000TransfectionReagent4 μL至體積為50μL，輕輕混勻，室溫作用5min；

混合稀釋的質粒和稀釋的Lipofectamine3000，此時總體積為100μL，輕輕 混勻，室溫作用20min；

逐滴將所得混合物加入到不同孔中，邊加邊搖動培養板，輕輕混勻；同時 設立2孔未轉染空白對照；

于37℃、5％的CO₂培養箱中48h后，加入含500μg/mLG418的DMEM/F12 培養基進行篩選。

4.如權利要求1所述的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征 在于，所述真核表達質粒pCI-neo-hTERT轉染細胞24h后給細胞換液，48h后加 含500μg/mLG418的DMEM/F12培養基篩選，從篩選第3天開始有細胞死亡， 第14天時，未轉染組細胞在G418作用下全部死亡，轉染組仍有少量細胞存活， 將G418濃度降至250μg/mL維持篩選，每日觀察，5d后出現陽性細胞克隆。

5.如權利要求1所述的永生化豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在 于，所述陽性克隆的方法有：

套環法：用套環套住陽性克隆，在套環內加胰酶或EDTA消化，把消化液 吸到另外一個新的培養孔中培養；

刮除法：刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續篩選培養；

無限稀釋法：將陽性細胞消化并計數，重新接種于96孔板，每孔1個細胞， 繼續培養使其長成單細胞克隆。