[發明專利]GII型諾如病毒病毒樣顆粒的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201610026951.5
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105462973A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 梁成珠;王群;孫濤;徐文菲;張曉文;岳志芹;房保海;趙玉然;賈俊濤;王宮璞
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N7/04;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉帥帥

技術領域

本發明涉及一種含有諾如病毒GII型基因的病毒樣顆粒的制備方法及應用。

背景技術

諾如病毒，又稱諾瓦克病毒（NorwalkViruses，NV）是人類杯狀病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中諾如病毒（Norovirus,NV）屬的原型代表株。它是一組形態相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾如病毒最早是從1968年在美國諾瓦克市暴發的一次急性腹瀉患者糞便中分離的病原。2002年8月第八屆國際病毒命名委員會批準名稱為諾如病毒，它與在日本發現的札幌樣病毒，合稱為人類杯狀病毒。諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內均有流行，全年均可發生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節呈現高發。美國每年在所有的非細菌性腹瀉暴發中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發達國家也都有類似結果。在中國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%左右，血清抗體水平調查表明中國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。

目前，食品中諾如病毒GII型檢測的常用方法有RT-PCR技術和熒光定量RT-PCR技術，為了保證檢測的準確性，實驗中必須設立陽性對照或質控品。通常使用病毒培養物或是由RNA逆轉錄得到的cDNA做標準品，但是前者存在生物安全的隱患且易被核糖核酸酶降解，后者不能體現核酸提取過程和反轉錄對試驗的影響。本發明采用ArmoredRNA技術，構建包裹甲肝病毒基因的假病毒標準樣品，此假病毒標準樣品能夠避免核糖核酸酶對RNA的降解，作為質控品可以對從核酸提取至RT-PCR檢測的全過程進行有效的監控。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：構建包裹NV-GII基因的病毒樣顆粒假病毒和標準樣品，此假病毒標準樣品能夠避免核糖核酸酶對RNA的降解，作為質控品可以對從核酸提取至RT-PCR檢測的全過程進行有效的監控。

本發明為解決上述技術問題，將編碼組氨酸標簽序列插入MS2噬菌體編碼外殼蛋白的β發夾環結構序列中，構建含有重組組氨酸標簽的MS2噬菌體外殼蛋白和表達成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重組質粒。并通過RT-RCR技術擴增NV-GII基因，將其克隆于pNH-MS2his中，構建原核重組表達質粒pNH-MS2his-NV-GII。并將其轉化于表達大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達。結果表明，表達的重組蛋白能夠自主裝配形成VLPs，而且其中含有NV-GII的基因RNA序列，并且該RNA序列具有良好的穩定性，可以作為RNA病毒檢測時的標準品和質控品用于臨床及海關樣品檢測。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

首先，本發明設計了一組擴增NV-GII基因引物，序列如下：

NV-GIIf1：ATACCACAATGATACCACACTCCCA

NV-GIIr1：AAGAGGACACTGTGAACTCTCCAC

引物5‘端分別加上HindII和NotI酶切位點。

5‘端和3’端分別加上HindIII和NotI酶切位點。

本發明提供一種pNH-MS2his重組質粒，pNH-MS2his重組質粒中插入的NV-GII基因片段序列如下：

ACAATGATACCACACTCCCAAAGACCCATACAACTAATGTCTTTGCTGGGCGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATTAGCAAGCTAGTCATTGCAGAACTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCC。

本發明還提供一種制備含有NV-GII基因的病毒樣顆粒標準物質的方法

包括以下步驟:

（1）含有組氨酸標簽的VLPs重組質粒pET-NH-MS2his的構建