[發(fā)明專利]GII型諾如病毒病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610026951.5
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105462973A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁成珠;王群;孫濤;徐文菲;張曉文;岳志芹;房保海;趙玉然;賈俊濤;王宮璞
• 申請（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N7/04;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 劉帥帥

1.一組擴(kuò)增NV-GII基因的引物，其特征在于，序列如下：

NV-GIIf1：ATACCACAATGATACCACACTCCCA；

NV-GIIr1：AAGAGGACACTGTGAACTCTCCAC；

引物5‘端分別加上HindII和NotI酶切位點。

2.一種pNH-MS2his重組質(zhì)粒，其特征在于，pNH-MS2his重組質(zhì)粒中插入的的NV-GII基因片段序列如下：

ACAATGATACCACACTCCCAAAGACCCATACAACTAATGTCTTTGCTGGGCGAGGCCGCACTCCACGGCCCAGCATTCTACAGCAAAATTAGCAAGCTAGTCATTGCAGAACTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCC。

3.制備含有NV-GII基因的病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法，其特征在于，包括下列步驟：

（1）含有組氨酸標(biāo)簽的VLPs重組質(zhì)粒pET-NH-MS2his的構(gòu)建

將pET32a質(zhì)粒使用XbaI和NcoI消化，去除其中的XbaI和NcoI兩個酶切位點間的序列，將人工合成的5’-PO4-CTAGATTACAAGGC-3’和5’-PO4-CATGGCCTTGTAAT-3’兩條互補的寡核苷酸復(fù)性后插入其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-NH，測序鑒定；

采用一步法擴(kuò)增試劑盒以MS2Pf1和MS2Pr1為引物,以MS2RNA為模板擴(kuò)增MS2目的片段；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的片段，用50μLddH2O洗脫，標(biāo)記為MS2DNA；

采用OneStepRT-PCR，以得到的MS2DNA為模板，分別用引物MS2Pf1和ms2hispr以及ms2hispf和MS2Pr1擴(kuò)增MS2上和MS2下2個DNA片段；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后，存于4℃?zhèn)溆茫辉僖?個片段的混合物為模板，以MS2Pf1和MS2Pr1為引物做PCR，得到引入了編碼組氨酸標(biāo)簽序列的MS2DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后的PCR產(chǎn)物命名為MS2his；

分別將制備的pET-NH載體和回收的MS2his片段用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切消化；將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后與pET-NH載體用SolutionⅠ連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落作進(jìn)行酶切鑒定；從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5ml的含有Amp抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取；以提取的質(zhì)粒為模板，以MS2Pf和MS2Pr為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測；若可見載體與1700bp的MS2目的片段即為陽性；

（2）構(gòu)建原核表達(dá)載體pNH-MS2his-NV-GII

按RNA提取試劑盒說明書的方法提取NV總RNA作為模板，以NV-GIIf1和NV-GIIr1，為引物，擴(kuò)增NV-GII蛋白基因，RT-PCR體系為：5×RT-PCRbuffer5μL，dNTPmix1μL，EnzymeMix1μL，引物NF和NR各1μL，RNA模板5μL，ddH2O補足25μL，反應(yīng)條件為,50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃滅火變性10min，然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，40個循環(huán)，最后72℃延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見430bp的條帶，寶生物凝膠回收試劑盒回收NV-GII蛋白片段；

HindⅢ和NotⅠ雙酶切pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，膠回收試劑盒回收酶切的pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，回收產(chǎn)物16℃連接過夜；連接體系為載體pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段分別為2μL和6μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4連接酶buffer1μL；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將涂板后獲得的重組克隆進(jìn)行PCR鑒定；將陽性克隆菌種送測序，鑒定為陽性的重組載體命名為pNH-MS2his-NV-GII；

（3）誘導(dǎo)及純化重組pNH-MS2his-NV-GII質(zhì)粒

將測序正確的pNH-MS2his-NV-GII質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3），將陽性克隆菌株接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)6h；離心收集菌體；菌體中加入裂解緩沖液重懸，于冰上放置30min，離心去除菌體碎片，將上清加入預(yù)裝有Ni-NTA的純化柱中，使液體自然流出，加入3倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌2次，然后加入洗脫緩沖液將病毒樣顆粒洗脫，命名為NV-GII-VLPs。