[發明專利]一種植物病毒抑制劑的快速篩選方法

在審

• 申請號: 201610026321.8
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105572089A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 孫現超;許博文;張旺;魏周玲;趙城鋼;杜利娟;青玲
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于病毒抑制劑篩選技術領域，尤其涉及一種植物病毒抑制劑的快 速篩選方法。

背景技術

室內常用的植物病毒抑制劑的篩選方法大多采用枯斑半葉法，其方法是將 病毒接種到兩片不同的半葉并通過對比統計枯斑數量處理前后枯斑數量來確定 藥劑藥效，但傳統方法所用時間周期長，結果不夠準確可靠，有時候還會與田 間藥效結果不一致。而對于沒有合適枯斑寄主的植物病毒，只能對病毒系統侵 染的寄主進行病害分級，然后計算植物病毒抑制劑藥效，時間周期更長且結果 不穩定。

發明內容

本發明的目的在于提供一種植物病毒抑制劑的快速篩選方法，旨在為植物 病毒抑制劑研發過程中初始抗病毒評價篩選提供新的手段。

本發明是這樣實現的，一種植物病毒抑制劑的快速篩選方法，所述植物病 毒抑制劑的快速篩選方法包括：

制備含有TMV-GFP的農桿菌菌液，取培養至5-6葉期生長健壯的本氏煙， 在葉片背面用針頭打一小孔，用去掉針頭的2mL針管吸取含有TMV-GFP的農 桿菌重懸液，注射到葉片內，每個注射點注射50-100μLOD₆₀₀為0.4-0.8的上述 菌懸液；

注射1天后，用待評價的植物病毒抑制劑噴霧處理注射葉片，植物病毒抑 制劑為0.5％氨基寡糖素水劑400倍液，同時，利用清水噴霧處理做對照，2天 后利用UV光照射，將藥劑處理葉片和清水對照處理葉片放在同一視野中拍照， 并在圖片分析軟件中十字交叉測葉片熒光擴散直徑，以平均值為最終數據，對 比分析植物病毒抑制劑對攜帶GFP的TMV抑制效果。

進一步，所述將含有TMV-GFP的農桿菌重懸液注射到4-6葉期本氏煙葉片， 具體包括：

從-80℃冰箱中取出含TMV-GFP全長載體的農桿菌菌液5μL；

將5μL菌液加入5mL含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中，225 rpm/min，30℃，培養12-16h；

從5mL菌液中取1mL加入濃度為20μM的乙酰丁香酮5μL，加入到25mL 含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中225rpm/min，30℃培養12-16h；

從25mL農桿菌菌液中取2mL加入到50mL離心管中，室溫5000rpm/min 離心15min，棄上清；

將沉淀用新配置的緩沖液重懸并調節OD₆₀₀值至0.6，室溫靜置3h；

取培養至5-6葉期生長健壯的本氏煙，在葉片背面用針頭打小孔，用去掉針 頭的2mL針管吸取農桿菌懸浮液注射到葉片內，每個注射點注射30μLOD₆₀₀為0.6的菌懸液。

進一步，所述緩沖液為10mL體系，包括：MgCl₂(1M)0.1mL，MES(0.5M) 0.2mL，AS(100mM)10μL加滅菌水至10mL。

進一步，所述病毒抑制劑的處理時間必須為含有TMV-GFP的農桿菌重懸液 注射1天后，激發波長為365nm的UV光照射并拍照記錄時間必須為含有 TMV-GFP的農桿菌重懸液注射3天后。

進一步，所述含有TMV-GFP的農桿菌菌液的制備方法如下：

從-80℃冰箱中取出含TMV-GFP全長載體的農桿菌菌液5-10μL；

將5-10μL菌液加入5-10mL含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中，220-250 rpm/min，28-30℃，培養12-16h；

從5-10mL菌液中取1-2mL加入濃度為20μM的乙酰丁香酮(AS)5-10μL， 加入到25-50mL含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中220-250rpm/min， 28-30℃，培養12-16h；

從25-50mL農桿菌菌液中取2-4mL加入到50-100mL離心管中，室溫， 5000rpm/min離心15min，棄上清；

將沉淀用新配置的緩沖液重懸并調節OD₆₀₀值至0.4-0.8，室溫靜置3-4h； 緩沖液配方10mL體系：取1M的MgCl₂0.1mL，0.5M的MES0.2mL，100mM 的AS10μL，其余加滅菌水至10mL。