[發明專利]一種植物病毒抑制劑的快速篩選方法

在審

• 申請號: 201610026321.8
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105572089A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 孫現超;許博文;張旺;魏周玲;趙城鋼;杜利娟;青玲
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種植物病毒抑制劑的快速篩選方法，其特征在于，所述植物病毒抑制 劑的快速篩選方法包括：

制備含有TMV-GFP的農桿菌菌液，取培養至5-6葉期生長健壯的本氏煙， 在葉片背面用針頭打一小孔，用去掉針頭的2mL針管吸取含有TMV-GFP的農 桿菌重懸液，注射到葉片內，每個注射點注射50-100μLOD₆₀₀為0.4-0.8的上述 菌懸液；

注射1天后，用待評價的植物病毒抑制劑噴霧處理注射葉片，植物病毒抑 制劑為0.5％氨基寡糖素水劑400倍液，同時，利用清水噴霧處理做對照，2天 后利用UV光照射，將藥劑處理葉片和清水對照處理葉片放在同一視野中拍照， 并在圖片分析軟件中十字交叉測葉片熒光擴散直徑，以平均值為最終數據，對 比分析植物病毒抑制劑對攜帶GFP的TMV抑制效果。

2.如權利要求1所述的植物病毒抑制劑的快速篩選方法，其特征在于，所 述將含有TMV-GFP的農桿菌重懸液注射到4-6葉期本氏煙葉片，具體包括：

從-80℃冰箱中取出含TMV-GFP全長載體的農桿菌菌液5μL；

將5μL菌液加入5mL含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中，225 rpm/min，30℃，培養12-16h；

從5mL菌液中取1mL加入濃度為20μM的乙酰丁香酮5μL，加入到25mL 含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中225rpm/min，30℃培養12-16h；

從25mL農桿菌菌液中取2mL加入到50mL離心管中，室溫5000rpm/min 離心15min，棄上清；

將沉淀用新配置的緩沖液重懸并調節OD₆₀₀值至0.6，室溫靜置3h；

取培養至5-6葉期生長健壯的本氏煙，在葉片背面用針頭打小孔，用去掉針 頭的2mL針管吸取農桿菌懸浮液注射到葉片內，每個注射點注射30μLOD₆₀₀為0.6的菌懸液。

3.如權利要求2所述的植物病毒抑制劑的快速篩選方法，其特征在于，所 述緩沖液為10mL體系，包括：MgCl₂(1M)0.1mL，MES(0.5M)0.2mL，AS(100mM) 10μL加滅菌水至10mL。

4.如權利要求1所述的植物病毒抑制劑的快速篩選方法，其特征在于，所 述病毒抑制劑的處理時間必須為含有TMV-GFP的農桿菌重懸液注射1天后，激 發波長為365nm的UV光照射并拍照記錄時間必須為含有TMV-GFP的農桿菌 重懸液注射3天后。

5.如權利要求1所述的植物病毒抑制劑的快速篩選方法，其特征在于，所 述含有TMV-GFP的農桿菌菌液的制備方法如下：

從-80℃冰箱中取出含TMV-GFP全長載體的農桿菌菌液5-10μL；

將5-10μL菌液加入5-10mL含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中，220-250 rpm/min，28-30℃，培養12-16h；

從5-10mL菌液中取1-2mL加入濃度為20μM的乙酰丁香酮(AS)5-10μL， 加入到25-50mL含有卡那霉素和鏈霉素YEP培養基中220-250rpm/min， 28-30℃，培養12-16h；

從25-50mL農桿菌菌液中取2-4mL加入到50-100mL離心管中，室溫，5000 rpm/min離心15min，棄上清；

將沉淀用新配置的緩沖液重懸并調節OD₆₀₀值至0.4-0.8，室溫靜置3-4h； 緩沖液配方10mL體系：取1M的MgCl₂0.1mL，0.5M的MES0.2mL，100mM 的AS10μL，其余加滅菌水至10mL。