[發(fā)明專利]一種多肽純化制備的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610024812.9
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN105504005A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張德志;趙晶;徐紅巖
• 申請（專利權(quán)）人: 上海吉爾多肽有限公司;吉爾生化（上海）有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 上海浦東良風(fēng)專利代理有限責(zé)任公司 31113
• 代理人: 張勁風(fēng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽純化制備方法，具體為一種利用反相高效液相色譜法結(jié)合乙腈的回收循環(huán)利用，對多肽進(jìn)行純化制備的方法。

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了各種多肽類藥物，多肽在臨床醫(yī)學(xué)中有巨大的應(yīng)用價值。自從發(fā)明固相法化學(xué)合成多肽以來，有關(guān)各種活性多肽的化學(xué)合成有了很大發(fā)展，但產(chǎn)物成分比較復(fù)雜，一般是以目標(biāo)多肽為主的幾種結(jié)構(gòu)相似的多肽混合物。因此，對這一混合物的分離純化一直是一個重要的研究課題，對其分離純化的最優(yōu)化研究就顯得格外重要。此外，提供高純度的多肽樣品，對于其物化性質(zhì)、生物活性及其醫(yī)藥功能的研究具有重要的作用。從現(xiàn)代分離科學(xué)理論得出，色譜和電泳是目前所知的分離效果最佳的兩種方法。電泳僅能用于分離而不能用于多肽的分離純化。而高效液相色譜經(jīng)過30多年的快速發(fā)展，在色譜理論研究、儀器研究水平、分析實(shí)踐應(yīng)用、質(zhì)量研究、工業(yè)化大生產(chǎn)等方面，已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步。其中反相高效液相色譜因其良好的選擇性，具有分離效果好、分辨率高、回收率高的特點(diǎn)，在多肽的分離純化中備受青睞，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，具有廣闊前景。

利用反相高效液相色譜對多肽進(jìn)行分離純化時，反向色譜柱填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的鍵合相，通常使用十八烷基硅烷鍵合硅膠。反向色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常以水、緩沖液為水相，甲醇、乙腈、異丙醇等為有機(jī)相，水相和有機(jī)相組成混合試劑進(jìn)行二元梯度洗脫。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

近年來，乙腈成為反相高效液相色譜常用的有機(jī)改性劑和溶劑，特別是在多肽分離純化領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。反相高效液相色譜對多肽進(jìn)行分離純化時，所使用的流動相（乙腈和水相）中，乙腈所占的比例為30%-70%（V/V），這樣大量的乙腈使用后不加以回收利用，非?？上В粌H會造成資源的浪費(fèi)，還會污染環(huán)境。

隨著霧霾天頻現(xiàn)，人們對大氣污染越來越關(guān)注。揮發(fā)性有機(jī)物作為四大總體污染物之一，是形成霾和PM2.5的前提物，是造成環(huán)境污染、損害人體健康的主要“元兇”，因此，國家對揮發(fā)性有機(jī)物的治理勢在必行。揮發(fā)性有機(jī)污染物早在上世紀(jì)八十年代，美國等發(fā)達(dá)國家就已經(jīng)開始重視揮發(fā)性有機(jī)污染物的減排問題。2010年5月國務(wù)院發(fā)布《關(guān)于推進(jìn)大氣污染聯(lián)防聯(lián)控工作改善區(qū)域空氣質(zhì)量的指導(dǎo)意見》，首次將揮發(fā)性有機(jī)物與二氧化硫、氮氧化物、顆粒物等一起列為大氣污染聯(lián)防聯(lián)控的重點(diǎn)污染物，提出加大揮發(fā)性有機(jī)物污染防治?！笆濉逼陂g，揮發(fā)性有機(jī)物污染治理和防控政策則進(jìn)入密集發(fā)布期，環(huán)?！笆濉币?guī)劃提出要開展揮發(fā)性有機(jī)物和有毒廢氣監(jiān)測，完善重點(diǎn)行業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)。目前，揮發(fā)性有機(jī)物治理已進(jìn)入我國大氣污染治理日程。2015年上半年，環(huán)保部印發(fā)了《揮發(fā)性有機(jī)物排污收費(fèi)試點(diǎn)辦法》，2015年12月17日，上海市發(fā)布《上海市揮發(fā)性有機(jī)物排污收費(fèi)試點(diǎn)實(shí)施辦法》，決定試點(diǎn)收取揮發(fā)性有機(jī)物排污收費(fèi)。試點(diǎn)分三個階段實(shí)施，逐步提高收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。針對這種情況，許多企業(yè)為了減少有機(jī)物排污，將產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物，如乙腈廢液等，進(jìn)行回收后，對其進(jìn)行精制，然后重新供給生產(chǎn)企業(yè)使用。

傳統(tǒng)的乙腈回收有變壓精餾法、恒沸精餾法、鹽析方法、脫水劑脫水法，這幾種方法均使用粗蒸及精餾兩個步驟，使用特殊的精餾方法進(jìn)行分離處理，存在處理方法復(fù)雜、設(shè)備成本高以及分離效率低，能耗高等問題。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)鹽方法是利用玻璃柱或者聚乙烯柱里面裝填陰陽離子樹脂，利用離子交換的原理實(shí)現(xiàn)多肽產(chǎn)品的轉(zhuǎn)鹽過程。另外利用傳統(tǒng)陰陽離子交換原理，對多肽產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)鹽，步驟1）在調(diào)整多肽產(chǎn)品液體的PH后，上樣掛柱2）沖洗樣品3）利用酸堿調(diào)整沖洗液的PH后將多肽產(chǎn)品沖洗下來，在此過程中，每一個環(huán)節(jié)都要取少許的流出液進(jìn)行HPLC檢測，確認(rèn)沖洗干凈后，方可進(jìn)行下一步工作。所以此方法，工作流程多，時間消耗大，而且會產(chǎn)生大量的廢液，更重要的是最后收集的多肽產(chǎn)品合格液體積大，不利于下面的濃縮和凍干工作。另外需要購置儀器設(shè)備和陰陽離子填料，還需另外安排實(shí)驗場地和人員，耗費(fèi)了大量的人力物力。

國內(nèi)外不乏關(guān)于反相高效液相色譜應(yīng)用的文獻(xiàn)，也有許多關(guān)于乙腈回收、精制的文獻(xiàn)資料，但是少有利用反相高效液相色譜法結(jié)合乙腈的回收循環(huán)利用，對多肽進(jìn)行分離純化的方法相關(guān)文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容