[發明專利]一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法

在審

• 申請號: 201610023569.9
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105543273A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 楊正安;丁玉梅;成曉靜;周麗英;卜璐璐;楊春雷
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/04;C07K14/00
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋 白方法。

背景技術

植物生物反應器與復雜并昂貴的細胞培養為基礎的表達系統相比,具有安全、廉 價和可大規模生產等優點。植物生物反應器的問世,為生產可食疫苗、藥用蛋白和提高植物 營養價值帶來了希望。然而,傳統的細胞核轉基因植物存在著外源基因表達效率低、環境安 全性差和后代不穩定等缺點，促使人們不得不致力于尋找一條新的途徑。以質體轉基因植 物作為生物反應器，不僅能夠實現外源蛋白的大量表達，而且外源蛋白可以形成正確的二 硫鍵和空間構象。因此,利用質體轉基因植物生產藥用蛋白等外源物質的研究日益受到關 注,并已經成為植物基因工程的一個新的研究熱點。質體轉化最早在藍藻(1988)獲得成功， 隨后迅速在煙草上得到趨于完善的發展，并相繼在擬南芥^[、番茄和甘藍等10余個物種上進 行了嘗試。40多個外源基因先后被穩定整合進質體基因組，賦予了植物抗除草劑、抗蟲、抗 病和抗旱等新的農藝性狀，高豐量表達了疫苗、抗體和干擾素等藥用蛋白質，嘗試生產了氨 基酸、工業用酶和生物大分子等原料^[14]。但要實現外源蛋白在植物質體中的穩定表達，有 幾個不足：一是外源基因對植物質體的遺傳轉化，是一個復雜且漫長的過程，通常要2-3年 才能實現，周期較長，對于急需生產應對突發疾病來說(例如SAS)，這一生產過程并不實用； 二是外源蛋白在質體中大都屬組成型表達，表達產物可能有毒或干擾植物細胞的其他新陳 代謝^[7]，抑制了植物體的正常生長。

利用植物體瞬時表達外源重組蛋白是植物生物反應器的一個重要研究方向，該體 系外源蛋白表達量高，實驗周期短，而且具有相對操作簡單的優勢，但整體來看接種方式是 影響該體系實驗效率的一個關鍵因素。傳統的接種方式主要有摩擦接種法、葉片注射法和 離體植物組織真空侵染法，其中摩擦接種法是將含有重組基因的載體在體外轉錄，并通過 機械方式在植物葉片上制造傷口，然后以轉錄產物涂抹或噴灑于植物葉片上進行接種，該 方法操作相對比較繁瑣，實驗費用較高。目前常用的離體植物組織真空侵染法主要是利用 真空壓力對離體的植物組織如葉片等進行接種，此方法操作簡單，但是在收獲

外源蛋白之前保持離體組織的新鮮度具有一定難度。葉片注射接種法是在活體植 物葉片上進行，要求植物具有2～3片展開的葉片，目前此種方法比較常用，但是在實驗操作 中發現此種接種方式很難實現在植物中批量的生產外源重組蛋白。本發明的目的在于提供 一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，利用植物質體trnI和trnA基因在高等植物 中高度保守的特點，根據煙草質體的trnI和trnA基因序列設計引物，從馬鈴薯中克隆trnI- trnA基因區段，并以此作為定點整合的同源區段，構建包含外源蛋白基因及質體特異性啟 動子Prrn和終止子TpsbA的植物質體表達載體，對基因槍參數進行優化，采用基因槍轟擊的 方式，在馬鈴薯塊莖的瞬時表達了個源蛋白，驗證外源蛋白的表達特性，為進一步將利用馬 鈴薯等作物器官作為生物反應器來表達外源蛋白快速生產藥用蛋白，生物抗體等奠定基 礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，利用植物 質體trnI和trnA基因在高等植物中高度保守的特點，根據煙草質體的trnI和trnA基因序列 設計引物，從馬鈴薯中克隆trnI-trnA基因區段，并以此作為定點整合的同源區段，構建包 含GFP基因(外源基因)、篩選標記基因aadA及質體特異性啟動子Prrn和終止子TpsbA的馬鈴 薯質體表達載體，通過馬鈴薯塊莖的瞬時表達GFP蛋白，驗證外源蛋白的表達特性，為進一 步將利用馬鈴薯等作物器官作為生物反應器來表達外源蛋白快速生產藥用蛋白，生物抗體 等奠定基礎。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，包括以下步驟：

1)提取馬鈴薯幼嫩葉片中的總DNA；

2)根據馬鈴薯質體基因中的trnI-trnA基因序列設計合成了引物C1和C2：

C1：5′-taaggtgttgggttaagtcccgcaacgagc-3′；

C2：5′-aactccccgaagcatttcgtcgattactacgccc-3′；