[發(fā)明專利]一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610023569.9
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105543273A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設計）人: 楊正安;丁玉梅;成曉靜;周麗英;卜璐璐;楊春雷
• 申請（專利權）人: 云南農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/04;C07K14/00
• 代理公司: 北京國智京通知識產(chǎn)權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

1.一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，其特征在于包括以下步驟：

1)提取馬鈴薯幼嫩葉片中的總DNA；

2)根據(jù)馬鈴薯質體基因中的trnI-trnA基因序列設計合成了引物C1和C2；

3)以供試馬鈴薯的總DNA為模板，用高保真DNA聚合酶擴增trnI-trnA基因特異片段，連 入pUC18載體，進行序列測定，得到陽性克隆；

4)設計兩對引物GLI1、GLI2和GLA1、GLA2，分別擴增陽性克隆的trnI和trnA區(qū)段；

5)將所擴增的trnI區(qū)段分別用ClaI和HindIII進行消化，連接入經(jīng)ClaI和HindIII內 切酶消化的pBio-3載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑取轉化菌落，獲得pBMLSI-GFP；

6)用MluI和EagI消化所擴增的trnA基因區(qū)段，連入經(jīng)MluI和EagI內切酶消化的 pBMLSI-gfp載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑取轉化菌落，培養(yǎng)后提取質粒，完成GFP基因馬鈴薯 質體表達載體pBMLSIA-GFP的構建。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，其特征在于： 所述的引物C1如SEQIDNO.1所示，引物C2如SEQIDNO.2所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，其特征在于： 所述的引物GLI1序列如SEQIDNO.3所示，所述的引物GLI2序列如SEQIDNO.4所示，所述 的引物GLA1序列如SEQIDNO.5所示，所述的引物GLA2序列如SEQIDNO.6所示。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，其特征在于： 步驟(4)中PCR擴增體系為：100μLPCR反應體系中加10×PCR反應緩沖液10μL，5’端和3’端 各0.2μmol，5UTaqDNA聚合酶，50ng模板DNA,MgCl₂為2.0mmol/L，各種dNTP為0.2mmol/L。

5.根據(jù)權利要求4所述的一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，其特征在于： 反應條件為：95℃總變性3min，94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸180s，共進行30個循 環(huán)。