[發明專利]雌根結線蟲食道腺基因原位雜交技術及其應用

有效

• 申請號: 201610023504.4
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105463113B
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 王新榮;張勁藹;陳芳妮;祝樂天;孫思;吳路平
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

本發明公開了一種雌根結線蟲食道腺基因原位雜交技術及其應用，屬于雌根結線蟲基因表達檢測技術領域。本發明針對雌根結線蟲蟲體易破裂的特點，在原位雜交的過程中采用針灸針在雌根結線蟲成蟲的前體部輕輕地扎1?2個小孔，提供了避免蟲體破裂的方法；本發明還提供了雌根結線蟲的固定技術；本發明改用96孔板實驗可以減少蟲體挪動，避免了離心管中因大量蟲子聚集擠壓造成的變形，而且雌蟲體積較大，較重，不需要離心即能沉到底部，省去離心的步驟，能更好的維持蟲體不變形。通過技術創新，在南方根結線蟲雌成蟲食道腺中實現了基因的原位雜交。

技術領域

本發明涉及雌根結線蟲基因表達檢測技術，具體涉及一種雌根結線蟲食道腺基因原位雜交技術及其應用。

背景技術

原位雜交組織化學技術(簡稱原位雜交In situ hybridization，ISH)是利用帶有標記物的核酸(DNA或RNA)探針檢測組織或細胞內待測核酸的表達和分布情況，已知序列的探針和組織或細胞內的待測核酸通過堿基互補配對結合，探針上帶有的特定標記物，可以和相應的檢測系統通過組織化學或免疫組織化學的方法在待測核酸的原位形成有色的雜交信號；尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，是分析低豐度和罕見的mRNA表達的重要技術，已成為最有效的分子病理學技術。

根結線蟲(Meloidogyne spp.)可以寄生2000多種植物，給農作物生產帶來嚴重損失；根結線蟲生活史在25約28天；包括卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、四齡幼蟲和和成蟲階段；其中二齡幼蟲呈線形，雌成蟲膨大呈球形或檸檬形(圖1)；雌根結線蟲蟲體體積最大，在寄主體內存活時間較長。

根結線蟲在一個生長季節可以繁殖3-4代，每代的繁殖量很大，平均每條雌蟲可產生300-500個卵，雌根結線蟲能夠成功產卵，是造成作物連作基地根結線蟲蟲口密度不斷上升的關鍵因素；但由于雌根結線蟲在植物體內，常規的防治技術難對其進行防治；近年來發展起來的基因沉默技術以及轉基因技術，可望創制出抗根結線蟲病植物材料。

運用原位雜交技術對根結線蟲中基因表達部位的研究已經有多篇報道，多種食道腺分泌蛋白已成功在南方根結線蟲二齡幼蟲上進行定位；但是所有報道均是對呈線狀蟲體的根結線蟲二齡幼蟲原位雜交技術。未見呈球形的雌根結線蟲原位雜交技術。

鑒于雌根結線蟲在寄主體內存活時間較長(15-18天)，對其寄主巨型細胞的調控中起到重要作用，因此建立針對雌根結線蟲的食道腺基因的原位雜交技術具有重要的科學意義和實踐意義。

發明內容

針對上述現有技術中存在的問題，本發明的首要目的是提供一種雌根結線蟲食道腺基因原位雜交技術。本發明人通過查閱已經發表的基因原位雜交文獻，針對雌根結線蟲蟲體易破裂的特點，設計并篩選出防止雌根結線蟲蟲體破裂的系列技術，從而成功建立了雌根結線蟲食道腺基因的原位雜交技術。

本發明的另一目的在于提供上述雌根結線蟲食道腺基因原位雜交技術的應用。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：一種雌根結線蟲食道腺基因原位雜交技術，包括如下步驟：

(1)收集活體南方根結線蟲雌成蟲，4℃2％多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22℃4h；

(2)將浸泡的線蟲去上清，加400μL 0.1×固定液重懸浮線蟲，吸置DEPC處理過的載玻片，用針灸針把成蟲的前體部扎1-2個小孔(避免把蟲體弄破)，然后將雌根結線蟲蟲體收集到滅菌處理后的96孔板中；

(3)將收集的線蟲用0.1×M9緩沖液漂洗2次，每次1min；

(4)裂解緩沖液22℃處理22min；去上清；

(5)0.1×M9緩沖液漂洗2次，每次1min；

(6)去上清，-78℃的干冰中處理20min；

(7)-20℃甲醇處理1min，去上清；