[發(fā)明專利]雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交技術(shù)及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610023504.4
• 申請(qǐng)日: 2016-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN105463113B
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王新榮;張勁藹;陳芳妮;祝樂天;孫思;吳路平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6841
• 分類號(hào): C12Q1/6841
• 代理公司: 廣東廣信君達(dá)律師事務(wù)所 44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)收集活體南方根結(jié)線蟲雌成蟲，4℃2％多聚甲醛溶液浸泡86h，然后22℃4h；

(2)將浸泡的線蟲去上清，加400μL 0.1×固定液重懸浮線蟲，吸置DEPC處理過的載玻片，用針灸針把成蟲的前體部扎1-2個(gè)小孔，然后將雌根結(jié)線蟲蟲體收集到滅菌處理后的96孔板中；

(3)將收集的線蟲用0.1×M9緩沖液漂洗2次，每次1min；

(4)裂解緩沖液22℃處理22min；去上清；

(5)0.1×M9緩沖液漂洗2次，每次1min；

(6)去上清，-78℃的干冰中處理20min；

(7)-20℃甲醇處理1min，去上清；

(8)-20℃丙酮處理1min，去上清；

(9)加入20％的丙酮，22℃水浴20min，去上清；

(10)預(yù)雜交：加入250μL 55℃預(yù)熱的雜交液，45℃輕搖1h；

(11)探針變性：探針在沸水中變性10min，并迅速置于冰水中≥5min，獲得變性的探針；

(12)將變性的探針加入到250μL 55℃預(yù)熱雜交液中，混勻，獲得終濃度為50ng/μL的混有探針的雜交液；

(13)將預(yù)雜交后的線蟲去除預(yù)雜交液，加入混有探針的雜交液，避光45℃雜交18h；

(14)步驟(13)雜交完成后，倒去雜交液，在45℃、4×SSC緩沖液中洗15min，去上清，重復(fù)3次；

(15)線蟲于37℃NTE緩沖液中洗10min，去上清；

(16)加入RNAse A消化未雜交探針，37℃處理1h；

(17)線蟲于45℃，0.1×SSC緩沖液，0.1％SDS中洗20min，去上清，重復(fù)3次；

(18)在22℃馬來酸緩沖液中浸泡5min去上清；

(19)加入適量新鮮配制的0.1×封閉液22℃保溫30min；去上清；

(20)新鮮配制的0.5mL抗體溶液22℃反應(yīng)2h，去上清；

(21)在洗滌緩沖液中浸泡15min去上清，重復(fù)3次；

(22)檢測(cè)緩沖液中平衡5min；去上清；

(23)加入250μL新鮮配制的顯色液試劑，4℃放置暗處，不要?jiǎng)訐u；顯色16h；

(24)去上清，M9緩沖液漂洗2次，每次1min，停止顯色，實(shí)現(xiàn)雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交；

為防止雌根結(jié)線蟲蟲體破裂，在上述步驟(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(24)中均不需要離心，直接去上清液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法，其特征在于：步驟(4)中所述的裂解緩沖液為含0.5mg/mL蛋白激酶K的M9Buffer。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法，其特征在于：步驟(11)中所述的探針為根結(jié)線蟲食道腺基因的原位雜交RNA探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法，其特征在于：所述的根結(jié)線蟲食道腺基因的原位雜交RNA探針為MiPDCD6基因的原位雜交RNA探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法，其特征在于：所述的MiPDCD6基因的原位雜交RNA探針由引物In-PD-T7F和引物In-PD-R擴(kuò)增獲得；其引物序列如下：

In-PD-T7F如SEQ ID NO：1所示；

In-PD-R如SEQ ID NO：4所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法，其特征在于：步驟(16)中所述的RNAse A為由NTE buffer稀釋成60μg/mL的RNAseA。

7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的雌根結(jié)線蟲食道腺基因原位雜交方法應(yīng)用于檢測(cè)目的基因在雌根結(jié)線蟲食道腺中的表達(dá)部位的用途。