[發(fā)明專利]一種在一管中進行磁珠提取核酸與擴增的實時熒光定量PCR方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610022581.8
• 申請日: 2016-01-14
• 公開（公告）號: CN105420403B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王海濱;王棽;周其玲;馮小霞
• 申請（專利權(quán)）人: 北京納捷診斷試劑有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京市躍揚知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11559
• 代理人: 李玉秋

本發(fā)明提供了一種在一管中進行磁珠提取核酸與擴增的實時熒光定量PCR方法，將混合有磁珠的裂解液和待檢測樣品加入到PCR擴增管中，混勻，靜置，進行磁吸后吸出混合液，將得到的磁珠洗滌一次；在上述PCR擴增管中加入配制好的PCR反應(yīng)液，對目標(biāo)核酸進行實時熒光定量PCR反應(yīng)；所述裂解液的組成為：0.2～0.4N氫氧化鈉、0.3～0.6M氯化鉀、0.01～0.05％N?月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.3～0.6M Tris?HCL和1～2％曲通X?100。本發(fā)明方法不需要加熱，室溫裂解時間5～10分鐘左右即可，只需靜態(tài)洗滌一次，從而減少了實驗室污染和磁珠核酸的丟失，避免了分步操作所帶來的污染可能性，節(jié)省了檢測時間。其敏感性以HBV DNA定量為例，可低至5IU/ML，重復(fù)性良好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種在一管中進行磁珠提取核酸與擴增的實時熒光定量PCR方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種根據(jù)生物體內(nèi) DNA復(fù)制性質(zhì)而設(shè)計的體外快速擴增特定DNA序列的技術(shù)。PCR反應(yīng)體系主要由核酸引物、4種dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反應(yīng)緩沖液體系組成。自美國Cetus公司人類遺傳室KaryMullis及其同事于1985年發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來，PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)就被快速開發(fā)出來，并在多種核酸檢測中得到了廣泛的運用。尤其是病毒或其他病原體的檢測，當(dāng)知道待檢病原某一特定基因片段時，即可利用特異性的引物對樣品中微量的目標(biāo)DNA進行PCR擴增，使其達到檢測量，通過適當(dāng)?shù)臋z測手段進行檢測，即可確定病原體的存在與否。

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用DNA 擴增過程中熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。與普通的PCR相比。實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，實現(xiàn)了PCR的定量分析。目前，實時熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究及臨床檢測中得到了廣泛應(yīng)用。

目前應(yīng)用于實時熒光定量PCR檢測的核酸提取方法主要有四種，即堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱法和磁珠法。

磁珠法提取核酸是通過細胞裂解液裂解細胞，從細胞中游離出來的核酸分子被特異的吸附到磁性顆粒表面，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附，而留在溶液中。反應(yīng)一定時間之后，再在磁場作用下，使磁性顆粒與液體分開，回收顆粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脫液洗脫，從而得到純凈的核酸。

目前，臨床實驗室中使用的磁珠法核酸提取大多采用胍鹽介導(dǎo)的方法，即在胍鹽的作用下，使核酸分子吸附于磁珠，再經(jīng)過洗脫得到靶核酸的方法。但其核酸提取與PCR擴增往往分別進行，并且提取過程中使用的胍鹽裂解液不穩(wěn)定，易受實驗室條件及季節(jié)溫度影響，洗脫過程中大多需要至少兩步洗滌，才能夠相對徹底地去除蛋白和鹽分子，進而增加了整個實時熒光定量PCR檢測過程的耗時。此外，由于核酸提取與PCR擴增不在同一載體中進行和洗滌次數(shù)的增加而導(dǎo)致的實驗室污染以及核酸丟失都是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要原因。因此，需要找到一種磁珠法提取與PCR擴增在同一載體中進行，裂解效率穩(wěn)定并且不需經(jīng)過多次洗脫的核酸提取方法對提高臨床檢測質(zhì)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中磁珠法提取核酸與實時熒光定量PCR擴增分別進行并且需要多次移管、核酸裂解效率不穩(wěn)定、磁珠核酸洗脫導(dǎo)致核酸丟失、核酸污染等缺點，提供了一種在一管中進行核酸提取與擴增的實時熒光定量PCR方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種在一管中進行磁珠提取核酸與擴增的實時熒光定量PCR方法，將混合有磁珠的裂解液和待檢測樣品加入到PCR擴增管中，混勻，靜置，進行磁吸后吸出混合液，將得到的磁珠洗滌一次；在上述PCR擴增管中加入配制好的PCR 反應(yīng)液，對目標(biāo)核酸進行實時熒光定量PCR反應(yīng)；