[發明專利]一種在一管中進行磁珠提取核酸與擴增的實時熒光定量PCR方法有效
| 申請號： | 201610022581.8 | 申請日： | 2016-01-14 |
| 公開（公告）號： | CN105420403B | 公開（公告）日： | 2019-04-05 |
| 發明（設計）人： | 王海濱;王棽;周其玲;馮小霞 | 申請（專利權）人： | 北京納捷診斷試劑有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 北京市躍揚知識產權代理事務所(普通合伙) 11559 | 代理人： | 李玉秋 |
| 地址： | 101111 北京市大興區北京*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 一管中 進行 提取 核酸 擴增 實時 熒光 定量 pcr 方法 | ||
1.一種在一管中進行磁珠提取核酸與擴增的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，將混合有磁珠的裂解液和待檢測樣品加入到PCR擴增管中，混勻，靜置，進行磁吸后吸出混合液，將得到的磁珠洗滌一次；在上述PCR擴增管中加入配制好的PCR反應液，對目標核酸進行實時熒光定量PCR反應；
所述裂解液的組成為：0.2～0.4N氫氧化鈉、0.3～0.6M氯化鉀、0.01～0.05％N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.3～0.6M Tris-HCL、3～8mM DTT和1～2％曲通X-100；
所述洗滌使用的洗滌液為0.3～0.6M氯化鉀溶液，所述洗滌液的pH值為4～5。
2.根據權利要求1所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述裂解液還包括不多于0.001wt％的提取指示劑，所述提取指示劑選自溴酚藍、石綠、甲基紅、甲基橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種。
3.根據權利要求2所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述提取指示劑為溴酚藍。
4.根據權利要求1所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
步驟1)將混合有磁珠的裂解液加入到PCR擴增管中；
步驟2)將待檢測樣品加入到所述混合有磁珠的裂解液中，混勻，室溫靜置5～10分鐘；
步驟3)將所述PCR擴增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一側后將混合液吸出；
步驟4)將PCR擴增管從磁力架上取下，將洗滌液加入步驟3)得到的PCR擴增管中，再將其放回磁力架上，待磁珠吸附至一側后，立即將洗滌液吸走；
步驟5)將配制好的PCR反應液加入到步驟4)得到的PCR擴增管中，使磁珠與所述PCR反應液充分混勻，離心，進行實時熒光定量PCR反應。
5.根據權利要求1、2或4所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述混合有磁珠的裂解液中磁珠和裂解液的體積混合比例為1～1.5：100。
6.根據權利要求4所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述混合有磁珠的裂解液、待檢測樣品和洗滌液的體積比為1：1：2。
7.根據權利要求4所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟2)所述待檢測樣品的加入量為50μl～150μl。
8.根據權利要求7所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述待檢測樣品的加入量為100μl。
9.根據權利要求4所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟2)所述待檢測樣品為細胞、細菌、血清、血漿、唾液、尿液或胸腹水。
10.根據權利要求9所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述待檢測樣品為血清或血漿。
11.根據權利要求1所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述洗滌液還包括不多于0.001wt％的洗滌指示劑，所述洗滌指示劑選自溴酚藍、石綠、甲基紅、甲基橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種。
12.根據權利要求11所述的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述洗滌指示劑為石綠。
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