[發(fā)明專利]一種血清外泌體中RNA的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610021424.5
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105505918B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾宏彬;羅寶花;陳杰
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州賽哲生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,宋靜娜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于RNA提取領(lǐng)域，尤其涉及一種血清外泌體中RNA的提取方法。

背景技術(shù)

外泌體(exosome)是一種30-100nm大小、極低密度的細(xì)胞外納米級囊狀結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過程而形成。外泌體在被發(fā)現(xiàn)后的很長一段時間內(nèi)都沒有引起研究者的注意，直到納米分析技術(shù)的引進(jìn)，以及2013年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎的公布，這個直徑只有幾十納米的顆粒受到了前所未有的重視。

據(jù)研究報道，外泌體中含有的內(nèi)容物如微RNA(mRNA、miRNA)、蛋白質(zhì)和信號復(fù)合物在受體細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)調(diào)控中有重要作用。如血清外泌體中的miRNA(exosomal-miRNA)具有獨(dú)特的介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的功能，能特異性抑制靶細(xì)胞中的靶基因表達(dá)，因此與游離miRNA相比，血清exosomal-miRNA水平的變化更加能代表惡性腫瘤的生物學(xué)功能的變化。另外，腫瘤細(xì)胞衍生外泌體通過傳遞的miRNA還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。目前，在腫瘤、生殖、血液和免疫等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，正開展一場與外泌體內(nèi)容物(如蛋白、RNA)功能機(jī)制分析有關(guān)的前所未有的研究熱潮。

由此可見，外泌體的成功分離及其內(nèi)容物的提取顯得尤其重要。傳統(tǒng)的外泌體分離提取方法是使用超高速差速離心法，該方法操作簡單但不適合大量樣品的制備，因為效率較為低下、易被污染。另外一種方法是超濾蔗糖密度梯度離心法，該方法分離到的外泌體純度高，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時，量少。還有一種就是免疫磁珠分選，該方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單，但非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步實(shí)驗。目前，分離外泌體采用最多的方法是免疫共沉淀原理進(jìn)行的，該方法操作簡便，能夠獲得高純度的外泌體樣本。典型代表有l(wèi)ife technology公司的Total Exosome Isolation Reagent、SBI公司的ExoQuick和ExoQuick-TC。

然而，現(xiàn)有的用于提取外泌體方法大多只是將外泌體這種完整的囊泡結(jié)構(gòu)提取出來，但是囊泡內(nèi)的微RNA以及腫瘤相關(guān)抗原等激活免疫細(xì)胞的重要成分很難提取。原因是外泌體本身性狀粘稠，極難打散，這導(dǎo)致在提取外泌體RNA的過程中，裂解液不易滲透進(jìn)去，致使裂解很難充分，裂解時間長。

目前，市場上用于提取外泌體RNA的試劑較少，life公司有專門提取的試劑盒，但價格昂貴，且該試劑盒用的是柱式法提取外泌體RNA，該方法得到的RNA純度高，但存在一個柱式法的普遍致命問題，就是柱式法損失量大，致使RNA提取量大大減少，該方法對于本身含量極低的血清來源外泌體中RNA來說，無疑還不是一種最佳的選擇方法。除了柱式法，還有另外一種經(jīng)典方法，就是常規(guī)的RNA沉淀法。該方法在外泌體RNA提取過程中，由于外泌體極粘稠的性狀，使常規(guī)的RNA沉淀法同樣存在外泌體裂解時間長，極難充分裂解等問題。

總而言之，不管采用哪種方法，血清中外泌體分離一直存在提取困難、提取量少、提取費(fèi)用昂貴等難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種血清外泌體中RNA的提取方法，本發(fā)明的RNA的提取方法具有提取時間短、效率高、效果好、試驗成本低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種血清外泌體中RNA的提取方法，包括以下步驟：

1)提取血清中的外泌體；

2)在超聲的作用下使用RNA提取試劑裂解步驟1)中提取的外泌體；

3)使用氯仿將步驟2)得到的裂解后的外泌體中的RNA分離至水相；

4)使用異丙醇沉淀步驟3)得到的水相中的RNA；

5)使用乙醇洗滌步驟4)中沉淀的RNA，之后再次溶解RNA，即得所述血清外泌體中的RNA。

優(yōu)選地，所述步驟1)中，使用Total Exosome Isolation試劑提取血清中的外泌體。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述RNA提取試劑為Trigene。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，超聲的頻率為28-35KHz，超聲處理時間為2-3min。

優(yōu)選地，所述步驟1)通過以下步驟實(shí)施：

11)將血清放置冰上溶解，加入Total Exosome Isolation試劑，充分混勻后，靜置冰上30min；

12)4℃離心，1500×g，10min；

13)移除所有上清，沉淀部分即為所述外泌體。

優(yōu)選地，所述步驟3)通過以下步驟實(shí)施：