[發明專利]一種血清外泌體中RNA的提取方法

有效

• 申請號: 201610021424.5
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105505918B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 曾宏彬;羅寶花;陳杰
• 申請（專利權）人: 廣州賽哲生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,宋靜娜

1.一種血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取血清中的外泌體；

2)在超聲的作用下使用RNA提取試劑裂解步驟1)中提取的外泌體；

3)使用氯仿將步驟2)得到的裂解后的外泌體中的RNA分離至水相；

4)使用異丙醇沉淀步驟3)得到的水相中的RNA；

5)使用乙醇洗滌步驟4)中沉淀的RNA，之后再次溶解RNA，即得所述血清外泌體中的RNA。

2.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于：所述步驟1)中，使用總外泌體分離試劑提取血清中的外泌體。

3.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述RNA提取試劑為Trigene。

4.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于：所述步驟2)中，超聲的頻率為28-35KHz，超聲時間為2-3min。

5.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于，所述步驟1)通過以下步驟實施：

11)將血清放置冰上溶解，加入總外泌體分離試劑，充分混勻后，靜置冰上30min；

12)4℃離心，1500×g，10min；

13)移除所有上清，沉淀部分即為所述外泌體。

6.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于，所述步驟3)通過以下步驟實施：

31)向步驟2)中裂解后的外泌體中加入氯仿，充分震蕩混勻，室溫靜置2min；

32)4℃離心，10000×g，10min；可見分為三層，RNA在上層水相，轉移水相。

7.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于，所述步驟4)通過以下步驟實施：

41)向步驟3)得到的水相中加入異丙醇，輕柔充分混勻，-20℃靜置過夜，沉淀RNA；

42)4℃離心，12000×g，15min；棄上清，即得沉淀的RNA。

8.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于，所述步驟5)通過以下步驟實施：

51)用75％乙醇洗滌步驟4)中沉淀的RNA；4℃離心，12000×g，5min；棄上清；

52)加入DEPC水溶解沉淀，即可得到血清外泌體中的RNA。

9.根據權利要求1所述的血清外泌體中RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.將250μL血清放置冰上溶解，再加入50μL總外泌體分離試劑，用槍輕輕吹打充分混勻后，靜置冰上30min；

B.4℃離心，1500×g，10min；

C.用槍頭盡量移除所有上清，沉淀部分即為外泌體；

D.將提取到的外泌體加入1mL Trigene，在頻率為28-35KHz的超聲波中超聲處理2-3min，即可使粘稠的外泌體充分裂解；

E.加入200μL氯仿，充分震蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置2min；

F.4℃離心，10000×g，10min；可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一新的無RNA酶EP管；

G.加入等體積的異丙醇，輕柔充分混勻，-20℃靜置過夜，沉淀RNA；

H.4℃離心，12000×g，15min；棄上清，再離心，吸去多余上清；

I.用75％乙醇洗滌兩次，須輕晃起沉淀物；4℃離心，12000×g，5min；棄上清；

J.加入20-50μL DEPC水溶解沉淀，即可得到血清外泌體的RNA。