[發明專利]用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的探針、引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201610021222.0
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN105463111B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 朱峰;鄒芳;段衛濤;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

本發明公開了用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的探針、引物及試劑盒，其中PIM1～PIM5的5組引物和探針，每組中突變引物能與PIK3CA基因保守序列結合，突變ARMS引物能與其相應的突變序列特異性結合，擴增突變序列；檢測探針能夠與擴增片段結合，阻斷探針能與突變位點對應的野生型序列特異性結合，抑制野生型非特異性擴增。本發明采用特異性突變引物和探針阻斷技術，可準確檢測PIK3CA基因5種突變類型；建立的實時熒光PCR擴增反應體系的試劑盒方便對PIK3CA基因突變的快速檢測，操作簡單，結果易讀；檢測方法靈敏度高，50拷貝突變能穩定檢出；特異性好，20ng野生型基因組DNA無非特異性擴增，檢測能力高達1％。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的探針、引物及試劑盒。

背景技術

PIK3CA基因定位于3q26.3，長34kb，包含20個外顯子，它為一個癌基因，該基因編碼的蛋白磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)在細胞生長、凋亡及腫瘤的形成過程中起重要的作用。PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B)信號通路是調節細胞功能的重要信號途徑，當PIK3CA基因以基因擴增或者點突變的形式激活時，其轉錄與翻譯水平升高，通過PI3K/AKT途徑使AKT過度激活，無節制地促進細胞的生長和繁殖，并且會抑制細胞的凋亡，最終將導致腫瘤的發生。

在多種人類實體瘤中都存在PIK3CA基因的突變。PIK3CA基因的突變包括基因的擴增、缺失和體細胞性的錯義突變等，PIK3CA基因在人體生理情況下一般多以非激活態形式存在，通常不易被檢測到，但作為癌基因，其突變后可高度表達。近來多篇報道指出PIK3CA基因在包括結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤中發生高頻體細胞突變。有研究發現PIK3CA基因的突變，近80％發生在螺旋區和激酶區，說明這些突變的位點并不是隨機產生的，而正是這種非隨機高頻率突變表明PIK3CA基因確實在腫瘤的發生中扮演著重要的角色。

EGFR是表皮生長因子家族中的一個，在腫瘤細胞的分化、增殖和抗凋亡過程中發揮著重要的作用。EGFR-TKI類藥物通過與細胞內酪氨酸激酶結構域上的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)位點競爭性結合，進而抑制其下游的信號轉導通路，誘導細胞凋亡。而臨床使用中只有75％-90％的EGFR藥物敏感突變的患者能夠從EGFR-TKI治療中獲益，而其余的患者會有原發性耐藥。EGFR-TKI的耐藥機制復雜，相關因素較多，PI3K作為EGFR下游信號分子，該基因被激活后可導致腫瘤細胞對EGFR-TKI藥物的耐藥，例如在結腸癌治療中，個體化靶向藥物西妥昔單抗(愛必妥)，帕尼單抗(維克替比)在PIK3CA基因發生突變的患者中治療無效，野生型治療全部有效。PI3K-Akt通路的活化可導致化療藥物耐藥，而抑制該通路則可以有效地改善化療耐藥，提高化療效果。有研究表明，PI3K通路抑制劑聯合包括EGFR-TKI在內的靶向藥物較單藥效果更好。因此，研究EGFR與PI3K通路的關系可以進一步了解腫瘤的發生發展及EGFR-TKI耐藥機制，為進一步解決EGFR-TKI耐藥問題奠定基礎，為指導臨床用藥給出治療策略。

目前基因突變檢測可以從兩個層次入手：一是蛋白質層次的間接檢測，主要借助一些蛋白質分析技術，分析突變體產生的變異蛋白，以及由變異蛋白引起的其他改變；二是對遺傳物質(主要是脫氧核糖核酸DNA)的直接檢測，主要以聚合酶鏈式反應(Polymerasechain reaction，PCR)技術為代表，該技術的檢測準確度與組織標本的結果符合率較高；測序法能夠直接得出目的DNA片段的堿基序列，但相對于眾多的突變檢測方法顯得費時費力。

發明內容

為了解決現有的PIK3CA基因突變檢測方法檢測效率低、樣品易污染、檢測時間長、準確性差、區分度困難等問題，本發明提供了用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的引物和探針。本發明還提供了含有該引物和探針的試劑盒，實現不限場地的快速準確檢測。