[發(fā)明專利]用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的探針、引物及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610021222.0
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN105463111B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發(fā)明（設計）人: 朱峰;鄒芳;段衛(wèi)濤;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

1.用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的試劑盒，其特征在于，包括用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的引物和探針，外控引物和探針，以及內控引物和探針；

用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的引物和探針的核苷酸序列如下：

PIM1：E542K突變

突變上游ARMS引物PIM1-F：SEQ ID NO:2，

突變下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，

檢測探針PIW1-P：SEQ ID NO:5，

阻斷探針PIW1-B1：SEQ ID NO:6；

PIM2：E545K突變

突變上游ARMS引物PIM2-F：SEQ ID NO:3，

突變下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，

檢測探針PIW1-P：SEQ ID NO:5，

阻斷探針PIW1-B2：SEQ ID NO:7；

PIM3：E545D突變

突變上游ARMS引物PIM3-F：SEQ ID NO:4，

突變下游引物PIW1-R：SEQ ID NO:1，

檢測探針PIW1-P：SEQ ID NO:5，

阻斷探針PIW1-B2：SEQ ID NO:7；

PIM4：H1047R突變

突變上游引物PIW2-F：SEQ ID NO:8，

突變下游ARMS引物PIM4-R：SEQ ID NO:9，

檢測探針PIW2-P：SEQ ID NO:11，

阻斷探針PIW2-B：SEQ ID NO:12；

PIM5：H1047L突變

突變上游引物PIW2-F：SEQ ID NO:8，

突變下游ARMS引物PIM5-R：SEQ ID NO:10，

檢測探針PIW2-P：SEQ ID NO:11，

阻斷探針PIW2-B：SEQ ID NO:12；

其中，所述檢測探針的核苷酸序列5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團；阻斷探針的核苷酸序列5’端經過雙脫氧修飾，3’端標記有淬滅基團；

外控引物和探針的核苷酸序列如下：

外控上游引物PIR-F：SEQ ID NO:13，

外控下游引物PIR-R：SEQ ID NO:14，

外控檢測探針PIR-P：SEQ ID NO:15，外控檢測探針核苷酸序列的5’端標記有FAM，3’端標記有MGB；

內控引物和探針的核苷酸序列如下：

內控上游引物IC-F：SEQ ID NO:16，

內控下游引物IC-R：SEQ ID NO:17，

內控檢測探針I(yè)C-P：SEQ ID NO:18，內控檢測探針核苷酸序列的5’端標記有JOE，3’端標記有BHQ1。

2.根據權利要求1所述的用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團為FAM，所述淬滅基團為MGB。

3.根據權利要求1所述的用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照品和內控品，陽性對照品包括含有5種突變序列基因的質粒PIM1質粒～PIM5質粒、含有PIK3CA基因保守序列>gi|224589815:178951951-178952350段堿基的外控質粒和含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段堿基的內控質粒，其中PIM1質粒～PIM3質粒均含有PIK3CA基因>gi|224589815:178935883-178936282段堿基序列，PIM4質粒～PIM5質粒含有PIK3CA基因>gi|224589815:178951951-178952350段堿基序列；內控品為含有matK基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段堿基的內控質粒。

4.根據權利要求1所述的用于檢測人類PIK3CA基因5種突變的試劑盒，其特征在于，試劑盒中的反應體系分為6個：

5個檢測反應體系：每1個檢測反應體系中包括用于檢測人類PIK3CA基因一種突變的引物和探針，內控引物和探針，AB premix，10×buffer和ddH₂O；

1個質控反應體系：包括外控引物和探針、內控引物和探針，AB premix，10×buffer和ddH₂O；

所述AB premix為美國應用生物系統(tǒng)公司產品Fast Advanced Master Mix；所述10×buffer為10倍濃度的緩沖液，緩沖液中含有Mg²⁺。