[發明專利]一種具有抗癌活性的OPB寡肽及其表達載體和應用

有效

• 申請號: 201610018929.6
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105601724B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 隋廣超
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/70;C12N15/66;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

1.一種具有抗癌活性的OPB寡肽的應用，其特征在于所述的OPB寡肽用于制備治療癌癥的藥物，所述的OPB寡肽的序列為：Gly-Asn-Lys-Lys-Trp-Glu-Gln-Lys-Gln-Val-Gln-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Thr-Met-Trp-Ser-Ser。

2.一種具有抗癌活性的2xOPB寡肽的制備方法，其特征在于它是按照以下步驟制備的：

一、將2xOPB DNA連接到pUC56載體上，構建得到pUC56-2xOPB載體；

二、將構建的pUC56-2xOPB用限制性內切酶BglII和XbaI在37℃酶切3小時：

三、將步驟二酶切得到的2xOPB片段用1％瓊脂糖電泳膠回收；

四、將步驟三回收的DNA片段連接到用限制性內切酶BglII和XbaI酶切后的pMBP載體，得到pMBP-2xOPB表達載體；

五、將步驟四構建的pMBP-2xOPB表達載體轉入大腸桿菌DH5α中，進行pMBP-2xOPB表達載體的表達和融合蛋白的分離，具體步驟如下：

1)培養后，采用限制性內切酶BglII和XbaI進行驗證，并進行DNA序列分析驗證，將驗證成功的pMBP-2xOPB表達載體轉入到大腸桿菌BL21Tuners菌株中并加入到LB培養基中形成菌液，菌液過夜培養；

2)將過夜培養的菌液加入到LB培養基中培養；

3)向培養后的菌液中加入終濃度為0.2mM的異丙基硫代半乳糖苷，繼續培養6小時或過夜培養；

4)將培養后的菌液離心收集細菌，用緩沖液1重新懸浮細菌；

其中，緩沖液1為20mM Tris-HCl、200mM NaCl和1mM DTT；

5)將重新懸浮細菌的菌液裝進離心管進行超聲波處理，測定細菌的裂解情況，直至蛋白完全釋放；

6)離心處理，保留上清液，即為蛋白粗提液，將所述粗提液用緩沖液1稀釋；

7)將稀釋后的粗提液與淀粉樹脂混合，用緩沖液1洗滌樹脂；

8)用帶有10mM麥芽糖的緩沖液1繼續進行洗脫，檢測洗脫液中的洗脫成分；

9)將洗脫下來的蛋白收集后進行透析以去除麥芽糖；其中，透析液為1.5 M NaCl、0.05M Tris-HCl和1mM DTT；

10)將透析后的樣品分裝凍存于﹣80℃；

活性肽段的切割及純化步驟如下：

1)用PSP酶與1×基準緩沖液配成1×裂解緩沖液，其中，1×基準緩沖液為20mM Tris-HCl pH7.0、150mM NaCl、1mM DTT和0.5mM EDTA；

2)將100ug的融合蛋白加入2單位的PSP蛋白酶，加入抑肽酶和亮抑肽酶，在5℃放置過夜；

3)加入淀粉樹脂，將切掉的MBP與其充分結合；

4)用緩沖液1進行洗脫活性肽段2×OPB；

5)將得到的活性肽段用0.22uM濾膜過濾，分裝凍存于-40℃，即完成活性肽段的切割及純化；

所述的2xOPB的核苷酸序列共294bp，其序列如下：

AGATCTCTGGTGCCGCGTGGTTCAGGTTATGGTCGCAAAAAACGTCGCCAACGCCGTCGTGCTGGTTACCCGTATGATGTGCCGGATTATGCCGGCGGATCCGGCGGTGGCGGTGGCAACAAAAAATGGGAACAGAAACAAGTGCAGATTAAAACCCTGGAAGGCGAATTTAGCGTTACCATGTGGAGCAGCGGCGGCGGCGGCGGCAATAAAAAATGGGAACAAAAACAGGTTCAGATCAAAACGCTGGAAGGCGAATTTAGTGTTACGATGTGGTCCTCAGGTTAATCTAGA。

3.根據權利要求2所述的一種具有抗癌活性的2xOPB寡肽的制備方法，其特征在于步驟二的酶切反應體系為30μL，具體如下：

4.根據權利要求2所述的一種具有抗癌活性的2xOPB寡肽的制備方法，其特征在于步驟四的連接體系為15μL，具體如下：

反應條件為：在16℃溫度下過夜連接。