[發明專利]藍莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養基及脫毒育苗方法

有效

• 申請號: 201610018907.X
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105532470B
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: 胡恒康;張啟香;李紅波;張林華
• 申請（專利權）人: 江蘇斯耐歐農林科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 周烽

1.一種藍莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養基，其特征是包括不同誘導時期的五種培養基，各種培養基的原料及其附加量分別是：

（1） 超低溫預培養基：WPM培養基+ 20ml·L^-1甘油+136.8 g·L^-1蔗糖，pH5.2；

（2） 超低溫培養基：WPM培養基+300ml·L^-1甘油+150 ml·L^-1乙二醇+150ml·L^-1二甲基亞楓即DMSO+136.8 g·L^-1蔗糖，pH5.2；

（3）恢復培養基：WPM培養基+ 0.1mg·L^-1 玉米素即ZT + 0.1 mg·L^-1 1-萘乙酸即NAA+0.1 mg·L^-1赤霉素即GA₃+8.0 g·L^-1瓊脂粉+30 g·L^-1蔗糖，pH5.2；

（4）芽增殖誘導培養基：WPM培養基+ 0.5mg·L^-1 ZT + 0.1 mg·L^-1NAA+0.1 mg·L^-1GA₃+8.0 g·L^-1瓊脂粉+30 g·L^-1蔗糖，pH5.2；

（5）生根壯苗培養基：WPM培養基+ 0.1 mg·L^-1NAA+8.0 g·L^-1瓊脂粉+30 g·L^-1蔗糖，pH5.2。

2.一種用權利要求1所述的藍莓莖尖干燥冷凍組培脫毒育苗培養基進行組培脫毒育苗的方法，其特征是經過下列步驟：

（1）藍莓莖尖干燥培養：選取組培繼代培養40±2d的藍莓無菌苗形態學上端長為0.5～1.0 cm的頂芽，置于無菌培養皿中，加蓋，但不密封，將該培養皿置于真空干燥器中，于室溫下干燥脫除鮮重重量10%~30%的水分；

（2）莖尖分離剝取及超低溫培養：在體視顯微鏡下剝取經干燥脫水處理的頂芽莖尖，莖尖長為1.0~1.5mm，置于1.8ml冷凍管中，每管置10個莖尖，加入超低溫預培養基2~5ml，在0℃條件下處理10~70min ，用無菌槍頭吸出超低溫預培養基，加入2ml超低溫培養基，并將冷凍管置于0℃冰水混合物中處理60 min，將冷凍管放入自制紗布袋中，迅速投入液氮中，保存60~120 min后，從液氮中迅速取出冷凍管，立即進行40℃水浴化凍處理0.2~1.5 min，再送入0℃冰水混合物中處理10min；將莖尖用WPM培養基+ 410.4 g·L^-1蔗糖溶液清洗3次，每次10 min，取出莖尖置于無菌濾紙上以吸去殘留在莖尖表面的液體，待接種到恢復培養基；

（3）恢復培養：為了減少培養過程中溫度和光照的抑制，將超低溫培養的莖尖接種至恢復培養基中先在0℃條件下暗培養5~7ｄ，再轉移至光暗周期為光16h/暗8h的條件下培養30d，培養溫度為25±2℃；

（4）病毒檢測：將以上通過干燥冷凍培養獲得的試管離體材料通過RT-PCR反轉錄病毒檢測，經檢測確認不帶病毒，即為藍莓脫毒種苗；

（5）芽誘導增殖培養：病毒檢測后確定脫毒的成活莖尖轉接至芽增殖誘導培養基中培養增殖出不定芽；微電腦時控開關控制培養室每日光照時間，每日光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為40~50μmol m^-2s^-1，培養溫度為25±2℃；

（6）生根培養：將步驟（5）所述的不定芽在生根壯苗培養基中誘導生根，培養30~45d，生根率達95%，光照培養，光暗周期為光16h/暗8h，光照強度為30~40μmol m^-2s^-1，培養溫度為25±2℃。