[發(fā)明專利]一種國槐離體葉片體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的快速繁殖方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610017997.0
• 申請(qǐng)日: 2016-01-12
• 公開（公告）號(hào): CN105660396B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李雙云;楊國良;李麗;龐彩紅;劉盛芳;王守國;張炳孝;夏陽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省林業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 曹麗

本發(fā)明公開了一種國槐離體葉片體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的快速繁殖方法，步驟如下選取國槐嫩枝消毒后，取帶有腋芽或頂芽的莖段，接入芽啟動(dòng)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)頂芽和腋芽萌發(fā)；將誘導(dǎo)出的新梢去掉基部葉片，切成含腋芽或頂芽的莖段接種在試管苗增殖培養(yǎng)基上，獲得無菌試管苗；取無菌試管苗的葉片接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成愈傷組織；將上述愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)形成叢生芽小苗；將叢生芽小苗切成愈傷塊轉(zhuǎn)接到試管苗增殖培養(yǎng)基或不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；將培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)后即可煉苗移栽。本發(fā)明方法，再生率高、出芽多，植株移栽成活率可達(dá)到95％以上，種苗生長健壯，不但可有效解決優(yōu)良種苗種質(zhì)退化問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種國槐離體葉片體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的快速繁殖方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

國槐(Sophora japonica Linn)，別名家槐、中國槐，屬蝶形花亞科、槐屬。國槐為落葉喬木，樹勢(shì)優(yōu)美，花期較長，極耐修剪，耐寒、耐旱、耐空氣污染，又是吉祥、幸福、美好的象征，是理想的行道樹種和庭院綠化樹種，而且國槐材質(zhì)優(yōu)良，花、果實(shí)、根皮、樹皮可入藥，種子可榨油制皂，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，應(yīng)用前景十分廣闊。目前，國槐是嫁接龍爪槐、金枝槐、聊紅槐、蝴蝶槐等觀賞品種的唯一砧木樹種，苗木需求大。國槐主要以種子繁殖為主，但其開花結(jié)果具有大小年現(xiàn)象，且種子易受病蟲害危害，干癟、空洞現(xiàn)象嚴(yán)重。常規(guī)的育種方法，依靠種子或扦插繁殖，難以滿足生產(chǎn)的需求，基于此有必要對(duì)國槐進(jìn)行組培快繁研究，提供優(yōu)質(zhì)、大量國槐種苗，切實(shí)解決國槐苗木需求的瓶頸。

國槐古樹資源歷經(jīng)千百年的風(fēng)霜?dú)q月，具有最原始的長壽和抗逆基因，但由于各種原因，衰老死亡的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。就古槐衰敗的現(xiàn)狀來看，常表現(xiàn)為樹干腐朽空洞、冠形殘缺、頂梢枯萎、枝葉凋零、病蟲害嚴(yán)重、根系生長不良等等。這些古槐是大自然和前人留給我們的寶貴的基因資源。

近年來，利用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有抗性如抗逆、抗蟲、抗病等新型品種是國槐育種的新趨勢(shì)。到目前為止，對(duì)槐樹的形成層培養(yǎng)、莖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、未授粉子房的培養(yǎng)均已獲得了完整的植株，對(duì)原生質(zhì)的培養(yǎng)也取得了一定的進(jìn)展。袁秀云等利用國槐的子葉和下胚軸產(chǎn)生了不定芽，王喆之等利用花藥培養(yǎng)形成了單倍體植株，Han K.H等(1993，1997)將直徑為0.5～1.0cm的枝條消毒后，取出形成層接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷，再將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，獲得了叢生芽，將成苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，可誘導(dǎo)生根。上述的方法存在的缺點(diǎn)：由于國槐為多年生木本植物，其再生率普遍較低，出芽少，直接影響了國槐的遺傳轉(zhuǎn)化。利用植物體胚誘導(dǎo)技術(shù)不但能達(dá)到保存母株優(yōu)良基因、快速繁育的目的，還是提高基因遺傳轉(zhuǎn)化或誘變育種的重要途徑。目前，有關(guān)國槐的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)技術(shù)研究的較少，可以參考的現(xiàn)有技術(shù)比較少。國槐為多年生喬木，基因組龐大，鑒于基因型的限制，其他物種的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的繁殖技術(shù)對(duì)國槐沒有參考價(jià)值。在這一方面，即使是同一物種，不同的品種之間，體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基也不相同。例如，同樣是國槐，同一種培養(yǎng)基，對(duì)黃金槐適合，對(duì)金葉槐就不適合。

專利CN 102499086 A公開了一種刺槐的繁殖方法，以不同胚齡的合子胚為外植體，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+瓊脂為胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；以MS基本培養(yǎng)基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-芐氨基腺嘌呤+蔗糖+瓊脂為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)，形成球形胚后將其轉(zhuǎn)接到MS+水解酪蛋白培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚的成熟培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)形成完整小植株。該專利使用刺槐的不同胚齡的合子胚(莢果)作為原料進(jìn)行體細(xì)胞培養(yǎng)，不論是刺槐還是國槐，其每年的花期以及果實(shí)期都是固定的兩個(gè)月左右，所以在進(jìn)行體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)具有時(shí)間的局限性；國槐的離體葉片、不成熟的合子胚均可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。但是，在山東地區(qū)，最近幾年的國槐小峰危害非常嚴(yán)重，很難采到無蟲害的完整種子。其次，相對(duì)于國槐葉片誘導(dǎo)來說，不成熟合子胚的誘導(dǎo)時(shí)間更長，且誘導(dǎo)出的叢生芽也不如葉片誘導(dǎo)的多。因此，本專利采用取材方便、誘導(dǎo)率高的葉片進(jìn)行國槐體胚誘導(dǎo)。國槐與刺槐分屬不同的屬，物種差別較大，不能參考莢果的體細(xì)胞培養(yǎng)得到葉片的體細(xì)胞培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容