[發明專利]一種國槐離體葉片體細胞胚誘導的快速繁殖方法

有效

• 申請號: 201610017997.0
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105660396B
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 李雙云;楊國良;李麗;龐彩紅;劉盛芳;王守國;張炳孝;夏陽
• 申請（專利權）人: 山東省林業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 曹麗

1.一種誘導國槐離體葉片體細胞胚的快速繁殖方法，其特征是：包括以下步驟：

(1)將國槐莖消毒后，取帶有芽的莖段，接入芽啟動培養基上，誘導頂芽和腋芽萌發，所述芽啟動培養基為：改良的MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；

(2)將誘導出的新梢去掉基部葉片，切成含芽的莖段接種在試管苗增殖培養基上培養，獲得無菌試管苗，所述試管苗增殖培養基為：改良的MS+1.0～2.0mg/L BA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；

(3)取無菌試管苗的葉片接種在體胚誘導培養基上培養形成愈傷組織，所述體胚誘導培養基為：改良的MS+3.0～5.0mg/L 2，4-D+0.5～1.0mg/L BA+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/L TDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；所述無菌試管苗的葉片接種時葉片的處理方法是：取無菌試管苗，從莖尖向下第3到第6片展開葉為材料，葉片帶短葉柄，用手術刀片垂直于葉片背面主脈劃3～4個傷口；

(4)將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上，培養形成叢生芽小苗，所述不定芽誘導培養基為：改良的MS+0.1～0.5mg/L BA+0.1～0.5mg/L NAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；

(5)將叢生芽小苗切成愈傷塊轉接到試管苗增殖培養基或不定芽誘導培養基上進行增殖快繁培養；

(6)將增殖培養的叢生芽從基部切開，轉入壯苗培養基中，進行壯苗培養，所述壯苗培養基為：改良的MS+5.0g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；

(7)將壯苗培養后的小苗切成單株轉接到生根培養基上培養后，即可煉苗移栽，所述生根培養基為：1/2改良的MS+0.1～0.5mg/L IBA+0～0.05mg/L NAA+5.0g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0，所述1/2改良的MS是改良的MS全量減半；煉苗移栽的具體步驟為：將試管苗封口膜綁繩松開，在培養室適應1～2d，轉入遮光度50％的溫室中，去掉封口膜，煉苗2～3d，待小苗葉片上的氣孔自主開合后，用鑷子輕輕將小苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合育苗基質的花盆中，保持相對濕度在80％以上；

所述各步驟中培養條件除特殊說明外，均為培養室溫度白天25±2℃，夜晚18±2℃，光照強度1000～1500lx，光照時間16h/d；

上述各步驟中的改良的MS，包括MS常量營養元素、MS微量營養元素和改良的MS有機試劑；

所述MS常量營養元素的組分和其對應的濃度如下：硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，七水硫酸鎂370mg/L，無水磷酸二氫鉀170mg/L，二水氯化鈣440mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，七水硫酸亞鐵27.8mg/L；所述MS微量營養元素的組分和其對應的濃度如下：四水硫酸錳22.3mg/L，硫酸鋅8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化鉀0.83mg/L，鉬酸鈉0.25mg/L，硫酸銅0.025mg/L，氯化鈷0.025mg/L；所述改良的MS有機試劑的組分和其對應的濃度如下：鹽酸硫胺素10mg/L，煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，肌醇100mg/L。

2.如權利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是：所述步驟(1)之前還包括選取國槐嫩枝，所述國槐嫩枝為取無病蟲害的當年生嫩枝，除去多余的莖葉，用洗潔精仔細清洗后，流水沖洗1小時得到。

3.如權利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是：所述步驟(1)中消毒為：于超凈工作臺上，用體積分數為70％酒精浸泡30～60s，無菌水沖洗2～3次，再用質量分數為0.1％升汞溶液消毒10～15min，然后用無菌水沖洗4～6次。