[發(fā)明專利]一種TGEV S2基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610017546.7
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105543280A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋振輝;買買提·艾孜子;周玥;葉翠芳;代先進;王麗;胡洋
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學;西南大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;C12N7/01
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 姜彥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬傳染性胃腸炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的一種以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床癥狀的高度傳染性疾病，主要侵害2周齡以內(nèi)的仔豬，死亡率高達100％，各階段的豬都易感，給養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的損失。五、六十年代該病開始在我國有相關(guān)報道，近年來我國各個地方時有該病發(fā)生。當前還沒有特別有效的藥物來醫(yī)治該病，主要依靠接種疫苗來進行防控。TGEV主要是通過消化道粘膜和呼吸道粘膜感染易感豬群，可見腸道粘膜免疫誘導的SIgA能夠有效抵御TGEV感染。因此，研究一種有效刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答的新型疫苗，對TGE的防治具有重要意義。TGEVS蛋白具有主要的B淋巴細胞抗原決定簇，唯一誘導機體產(chǎn)生中和抗體并提供免疫保護作用的；且S蛋白含有宿主細胞氨肽酶受體(pAPN)的識別位點。因此在研究TGEV基因工程疫苗時將S基因作為首選靶基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，旨在以桿狀病毒為載體，表達TGEV主要抗原表位基因S₂，將重組桿狀病毒口服和肌注免疫小鼠，檢測小鼠糞便中的sIgA和血清中的IgG水平，試驗結(jié)果初步證明重組桿狀病毒可誘導小鼠產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫應(yīng)答。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，所述TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法包括：

S₂基因的擴增，用TGEV感染ST細胞，37℃培養(yǎng)48h，反復(fù)凍融，10000rpm/min離心10min，收集上清，利用RNAisoplus方法提取病毒總RNA，按照體系進行擴增；

重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，將回收的S₂基因和pFastBac^TMDual質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后連接，S₂基因定向克隆于pFastBac^TMDual的Ph啟動子下游，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac^TMDual-S₂，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的質(zhì)粒進行測序，用DNAstar軟件分析插入片段的正確性；

重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定，取5μL重組供體質(zhì)粒pFastBac^TMDual-S₂，將其轉(zhuǎn)入E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞，在含卡那霉素(50μg/ml)、慶大霉素(7μg/ml)、四環(huán)素(10μg/ml)、X-gal(100μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃避光培養(yǎng)48h，挑取白色較大的單個菌落，培養(yǎng)過夜，按照PureLink^TMHiPurePlasmidDNAPurificationKits的操作手冊提取穿梭質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組穿梭載體命名為Bacmid-S₂，用于轉(zhuǎn)染sf9細胞；

重組桿狀病毒的獲得及鑒定，將鑒定為陽性的Bacmid-S₂利用CellfectinRⅡReagent轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，27℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至出現(xiàn)病變，收獲細胞上清，進行PCR鑒定，將上清液在sf9昆蟲細胞盲傳3代，重組病毒命名為rBacmid-S₂；

SDS-PAGE檢測，分別用rBacmid-S₂P3代毒、野生桿狀病毒P3代毒感染Sf9細胞，27℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，反復(fù)凍融，10000rpm/min離心約10min,分別收集上清液和沉淀，配制分離膠和濃縮膠。

進一步，所述TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法選擇一對M13通用引物：

S₂上游引物：5'-ACTGAATTCATGTCATTGAACACAACGGGT-3'，其5'端斜體下劃線部分設(shè)計有EcoRⅠ酶切位點；