[發(fā)明專利]一種TGEV S2基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610017546.7
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105543280A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋振輝;買買提·艾孜子;周玥;葉翠芳;代先進;王麗;胡洋
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);西南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;C12N7/01
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 姜彥

1.一種TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述TGEV S₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法包括：

S₂基因的擴增，用TGEV感染ST細胞，37℃培養(yǎng)48h，反復(fù)凍融， 10000rpm/min離心10min，收集上清，利用RNAisoplus方法提取病毒總RNA， 按照體系進行擴增；

重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，將回收的S₂基因和pFastBac^TMDual質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和 SalⅠ雙酶切后連接，S₂基因定向克隆于pFastBac^TMDual的Ph啟動子下游，構(gòu) 建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac^TMDual-S₂，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)PCR鑒定，將初步鑒定為 陽性的質(zhì)粒進行測序，用DNAstar軟件分析插入片段的正確性；

重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定，取5μL重組供體質(zhì)粒pFastBac^TMDual-S₂， 將其轉(zhuǎn)入E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞，在含卡那霉素(50μg/ml)、慶大霉素 (7μg/ml)、四環(huán)素(10μg/ml)、X-gal(100μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的LB 瓊脂培養(yǎng)基上，37℃避光培養(yǎng)48h，挑取白色較大的單個菌落，培養(yǎng)過夜，按照 PureLink^TMHiPurePlasmidDNAPurificationKits的操作手冊提取穿梭質(zhì)粒DNA， 經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組穿梭載體命名為Bacmid-S₂，用于轉(zhuǎn)染sf9細胞；

重組桿狀病毒的獲得及鑒定，將鑒定為陽性的Bacmid-S₂利用CellfectinRⅡ Reagent轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，27℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至出現(xiàn)病變，收獲細胞 上清，進行PCR鑒定，將上清液在sf9昆蟲細胞盲傳3代，重組病毒命名為 rBacmid-S₂；

SDS-PAGE檢測，分別用rBacmid-S₂P3代毒、野生桿狀病毒P3代毒感染 Sf9細胞，27℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，反復(fù)凍融，10000rpm/min離心約10min, 分別收集上清液和沉淀，配制分離膠和濃縮膠。

2.如權(quán)利要求1所述的TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在 于，所述TGEVS₂基因重組桿狀病毒的構(gòu)建方法選擇一對M13通用引物：

S₂上游引物：5'-ACTGAATTCATGTCATTGAACACAACGGGT-3'，其5'端 斜體下劃線部分設(shè)計有EcoRⅠ酶切位點；

S₂下游引物：5'-CGTGTCGACTAAGCCACTAAGTAGCGTCCT-3'，其5'端斜 體下劃線部分設(shè)計有SalⅠ酶切位點；

M13上游引物：5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'；

M13下游引物：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'。