[發明專利]金針菇F101菌種的SSR標記引物及其指紋圖譜應用

有效

• 申請號: 201610017183.7
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105506124B
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 沈穎越;金群力;蔡為明;宋婷婷;范麗軍;馮偉林;李良英;田芳芳
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州賽科專利代理事務所(普通合伙) 33230
• 代理人: 張劍英

1.金針菇F101菌種的SSR標記引物，其特征在于，所述標記引物由名稱為Fvm1，Fvm2、

Fvm3、Fvm4、Fvm5、Fvm6的6對SSR引物構成；所述6對引物的正反核苷酸序列如下：

Fvm1：GAGGCGTCACCAAGGGATG、如序列表SEQ ID NO.1所示，CTCAAAGGAATGCGCTGCA、如序列表SEQ ID NO.2所示；

Fvm2：TTTCGCGCAGGTTTGG、如序列表SEQ ID NO.3所示，

TTGTGAGGGGACGGGTATG、如序列表SEQ ID NO.4所示；

Fvm3：GTGAAGAAGAATAAGAGGGAGC、如序列表SEQ ID NO.5所示，TGAGACTAGTGATGACGATGAAG、如序列表SEQ ID NO.6所示；

Fvm4：TCATCTGTCCATTCATCATCA、如序列表SEQ ID NO.7所示，GTTCAACACATTCACGCAA、如序列表SEQ ID NO.8所示；

Fvm5：CAGCCCATTTTTCCACCC、如序列表SEQ ID NO.9所示，CGAAGATTCCATTGACGATTTC、如序列表SEQ ID NO.10所示；

Fvm6：CATTGTTCCTTCAGTCCGAGA、如序列表SEQ ID NO.11所示，TTCCATCCGAATCCGTAGC、如序列表SEQ ID NO.12所示。

2.如權利要求1所述的金針菇F101菌種的SSR標記引物通過指紋圖譜在菌種檢測鑒定中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟如下：

（1）菌絲培養：將金針菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基中，18℃~20℃下避光搖瓶培養，5d-7d后收集菌絲；

（2）基因組DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；

（3）SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增； PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCRbuffer、2μL，25mmol/LMgCl2、2μL，10mmol/LdNTP、0.4μL，5U/μLTaqDNA酶、0.2μL，10μmol/LSSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20ng~30ng/μL提取的模板DNA、2μL，ddH2O、10.4μL；PCR反應條件：94℃、5min；94℃、30second，以引物的退火溫度30second，72℃30second，30個循環；72℃5min；

（4）電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與5μL加樣緩沖液混勻，點樣3.5μL于非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為10%，電泳緩沖液為1×TBE，電壓150v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結果；

（5）菌種鑒定：采用6對SSR引物對金針菇菌株進行PCR擴增，通過對照markerI可確定各SSR引物擴增的等位片段的數量和相對分子量，找到符合編號組合為：（1+2+3）（1+2+3）（1+2）（1+2）1（1+2）的菌種，即可確定該菌種為金針菇菌種。