[發明專利]一種雞TGFBR2基因甲基化檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201610016805.4
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105483263A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 李顯耀;王莎莎;王巧巧
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，提供了一種雞TGFBR2基因甲基化檢測方法及其應 用。

背景技術

雞腸炎沙門氏菌病是家禽生產中的常見疾病，腸炎沙門氏菌能夠透過蛋殼進入雞 蛋產品中，且能在生殖道中寄存繁殖。之前有報道，美洲等發達國家中發生的食物中毒事 件，大多數是由禽類的沙門氏菌而引起的，而其中，起主要作用的病原就是腸炎沙門氏菌。 腸炎沙門氏菌對家禽生產造成重大影響，引起畜禽發病，而且是食源性致病菌，能通過家禽 副產品給人類的健康帶來很大的威脅，是報道最頻繁的致病微生物之一；表觀遺傳修飾尤 其是基因的甲基化在在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育、腫瘤癌癥及相關疾病發生 中起著重要調控作用，而基因啟動子區域的甲基化能夠通過調控基因的表達影響各種疾病 的發生發展進程。

甲基化是基因表達調控的重要模式，TGFBR2基因可通過啟動子區域的高甲基化而 喪失活性，在多種疾病發生過程中發揮表達調控作用；目前尚沒有關于雞TGFBR2基因甲基 化檢測方法，以及TGFBR2基因在雞腸炎沙門氏菌感染中發揮的甲基化調控作用的報道。

發明內容

本發明的發明人針對上述現有技術的情況，結合長期研究和探索，提供了一種雞 TGFBR2基因甲基化檢測方法及其應用，該方法提供了雞TGFBR2基因甲基化檢測的特異性引 物及配合該引物使用的巢式PCR條件，利用上述引物和方法，可以準確檢測雞感染腸炎沙門 氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情況，并可以以此作為分子標記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提 供理論依據。

發明人提供的具體技術方案如下：

一種雞TGFBR2基因甲基化檢測方法，所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞TGFBR2 基因特異性的甲基化引物，其序列如下表所示：

上述引物前一對為第一對引物，后一對為第二對引物，利用上述2對特異性引物對 經亞硫酸鹽對修飾處理后的雞的全基因組基因DNA進行巢式PCR，2次反應條件一致，其PCR 擴增反應體系如下，每20μL體系為：

PCR擴增條件為：

其中所述的亞硫酸鹽修飾處理采用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對雞基因組DNA 進行亞硫酸鹽修飾處理，使未發生甲基化的胞嘧啶轉換成尿嘧啶，而發生甲基化位點因5′- 甲基胞嘧啶的保護而不發生變化。

而上述的PCR擴增條件也根據本發明的目的進行了對應調整，是在眾多備選條件 中優選出的最佳條件，可配合本發明的特異性引物起到最佳的檢測效果。

所獲得的擴增產物進行大腸桿菌克隆，轉化成功后直接進行測序，測序結果顯示， 腸炎沙門氏菌感染后TGFBR2基因中所檢測各CpG位點的甲基化受到激活，利用這一特性，可 以作為腸炎沙門氏菌感染的甲基化分子標記。

基于上述理由，利用本發明所述的雞TGFBR2基因甲基化檢測方法檢測待測雞群， 可以作為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供可靠的依據，并將其應用與養殖生產實踐中。

綜上所述，本發明的發明人首次提供了一種雞TGFBR2基因甲基化檢測方法及其應 用，該方法提供了雞TGFBR2基因甲基化檢測的特異性引物及配合該引物使用的巢式PCR條 件，利用上述引物和方法，可以準確檢測雞感染腸炎沙門氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情 況，并可以以此作為分子標記為雞抗腸炎沙門氏菌感染提供理論依據。

具體實施方式

下述實施例中除特殊說明之外，所采用的均為本領域現有技術；

實施例1

一種雞TGFBR2基因甲基化檢測方法，所采用的方法為巢式PCR，所采用的雞TGFBR2 基因特異性的甲基化引物，其序列如下表所示：

選擇腸炎沙門氏菌陰性的壽光雞6-10只，試驗組口服接種含菌量為10⁹cfu的腸炎 沙門氏菌菌液0.3mL，對照組接種0.3mLPBS緩沖液，接種后14日采集盲腸樣品，提取基因組 DNA，試驗組和對照組各取3-5只。

用QIAGEN公司甲基化修飾試劑盒對雞基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾處理，使未發 生甲基化的胞嘧啶位置轉換成尿嘧啶，而發生甲基化位點因5′-甲基胞嘧啶的保護而不發 生變化。