[發(fā)明專利]一種可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠的半抗原、人工抗原的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610016453.2
• 申請(qǐng)日: 2016-01-08
• 公開（公告）號(hào): CN105503632B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡睿;李斌;劉輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州潤坤生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07C229/18
• 分類號(hào): C07C229/18;C07C227/18;C07K14/795;C07K14/77;C07K14/765;G01N33/577
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠的半抗原、抗原制備方法。

背景技術(shù)

結(jié)晶紫和孔雀石綠均為有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，是殺菌和殺寄生蟲的化學(xué)制劑，可致癌。目前結(jié)晶紫和孔雀石綠的殘留檢測主要方法是采用氣相色譜(GC)，氣相質(zhì)譜(GCMS)，液相色譜(HPLC)或液相質(zhì)譜(LCMS)，以上方法雖然可以精確定量，但由于設(shè)備儀器昂貴，檢測時(shí)間長，且需專業(yè)人員操作，因此無法實(shí)現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場檢測。免疫分析檢測技術(shù)是近年來在環(huán)境及食品檢測等領(lǐng)域開發(fā)出來的一種新型快速準(zhǔn)確檢測方法，現(xiàn)已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一，也為結(jié)晶紫和孔雀石綠的檢測提供了新的途徑。

結(jié)晶紫和孔雀石綠分子本身沒有可與載體蛋白結(jié)合的可供活化的功能基團(tuán)，因此無法直接制備人工抗原，需先通過化學(xué)方法設(shè)計(jì)出其半抗原，再進(jìn)一步與載體蛋白結(jié)合獲得具有免疫性的完全抗原。由此產(chǎn)生了酶聯(lián)免疫法這一檢測手段。

在中國發(fā)明專利申請(qǐng)公布號(hào)為“CN103288661A”，公布日為2013年9月11日，名為《一種孔雀石綠半抗原制備方法及其應(yīng)用》的文件中，公開了一種孔雀石綠半抗原，相應(yīng)的人工抗原和單克隆抗體，同時(shí)公開了所述孔雀石綠半抗原，相應(yīng)的人工抗原和單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。此專利在制備半抗原化合物的過程中需要引入琥珀酸酐，合成的半抗原為酯類結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生水解，使抗原失活，不利于保存，無法滿足生產(chǎn)需求；

在專利公告號(hào)為“CN101451999A”的專利文件中，半抗原的合成需用到醋酐，三氯化鋁和溴素，其中醋酐為易制毒化學(xué)品，不易購得，而三氯化鋁和溴素均為高活性化學(xué)品，環(huán)境污染嚴(yán)重，且對(duì)人體傷害較大。

在專利公告號(hào)為“CN101948531A”的專利文件中，以副品紅為半抗原，但此結(jié)構(gòu)存在三個(gè)氨基，在與蛋白偶聯(lián)時(shí)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)半抗原分子偶聯(lián)一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)蛋白分子的可能，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)蛋白分子上一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)活性基團(tuán)偶聯(lián)一個(gè)半抗原分子的可能，使得合成的全抗原批間差較大，無法滿足生產(chǎn)要求。

在專利公告號(hào)為“CN104569372A”的專利文件中，合成的半抗原需用到醋酸鈀，此催化劑不僅價(jià)格昂貴，而且反應(yīng)需要在無水無氧的條件下進(jìn)行，催化劑在儲(chǔ)存和反應(yīng)過程中均易失活，在生產(chǎn)中存在極大風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠的半抗原、人工抗原的制備方法及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中制備的原料存在安全隱患，半抗原穩(wěn)定性差，抗原批間差較大、成本造價(jià)高的問題，同時(shí)保證對(duì)孔雀石綠、結(jié)晶紫的高交叉反應(yīng)率。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供技術(shù)如下：

一種可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠半抗原，所述可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠半抗原的結(jié)構(gòu)通式如下：

其中n的取值范圍為1-5中任意一個(gè)整數(shù)。

一種可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠半抗原的制作方法，包括如下步驟：

(a)：將4-甲胺基苯甲醛與通式(Ⅰ)所示化合物在無水乙醇和縛酸劑的條件下進(jìn)行取代反應(yīng)獲得通式(Ⅱ)所示化合物，

通式(Ⅰ)為：

通式(Ⅱ)為：

(b)：將通式(Ⅱ)所示化合物溶解于無水乙醇中，加入N，N—二甲基苯胺和氯化鋅，進(jìn)行縮合反應(yīng)，獲得通式(Ⅲ)所示化合物，

通式(Ⅲ)為：

(c)：將通式(Ⅲ)所示化合物溶解于無水乙醇中，加強(qiáng)堿溶液至PH值為10-11，反應(yīng)獲得通式(Ⅳ)所示的半抗原，

通式(Ⅳ)為：

其中，通式(I)中n的取值范圍為1-5中任意一個(gè)整數(shù)，通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)中的n取值與通式(Ⅰ)一致，通式(I)中R為Cl，Br或I中的任意一種。

一種可共同用于檢測結(jié)晶紫和孔雀石綠半抗原的制作方法，按下面比例和步驟制作：

(a)把4-甲胺基苯甲醛和通式(Ⅰ)所示化合物以摩爾比為1：1～1.5的量溶于無水乙醇中，加入K₂CO₃，K₂CO₃與4-甲胺基苯甲醛的摩爾比為0.5～1：1，然后80～90℃回流2～5h，反應(yīng)完畢，減壓去溶劑，加入純化水，再用乙酸乙酯萃取，減壓去溶劑，石油醚結(jié)晶，得到通式(Ⅱ)所示化合物，