[發明專利]一種可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的半抗原、人工抗原的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201610016453.2
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105503632B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 胡睿;李斌;劉輝
• 申請（專利權）人: 廣州潤坤生物科技有限公司
• 主分類號: C07C229/18
• 分類號: C07C229/18;C07C227/18;C07K14/795;C07K14/77;C07K14/765;G01N33/577
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

1.一種可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的半抗原，其特征在于，所述半抗原的結構通式如下：

其中n是1或3或5。

2.一種可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的半抗原的制作方法，其特征在于：

包括如下步驟：

(a)：將4-甲胺基苯甲醛與通式(Ⅰ)所示化合物在無水乙醇和縛酸劑的條件下進行取代反應獲得通式(Ⅱ)所示化合物，

通式(Ⅰ)為：

通式(Ⅱ)為：

(b)：將通式(Ⅱ)所示化合物溶解于無水乙醇中，加入N，N—二甲基苯胺和氯化鋅，進行縮合反應，獲得通式(Ⅲ)所示化合物，

通式(Ⅲ)為：

(c)：將通式(Ⅲ)所示化合物溶解于無水乙醇中，加強堿溶液至pH 值為10-11，反應獲得通式(Ⅳ)所示的半抗原，

通式(Ⅳ)為：

其中，通式(I)中n是1或3或5，通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)中的n取值與通式(Ⅰ)一致，通式(I)中R為Cl，Br或I中的任意一種。

3.根據權利要求2所述的一種可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的半抗原的制作方法，其特征在于：

按下面比例和步驟制作：

(a)把4-甲胺基苯甲醛和通式(Ⅰ)所示化合物以摩爾比為1：1～1.5的量溶于無水乙醇中，加入K₂CO₃，K₂CO₃與4-甲胺基苯甲醛的摩爾比為0.5～1：1，然后80～90℃回流2～5h，反應完畢，減壓去溶劑，加入純化水，再用乙酸乙酯萃取，減壓去溶劑，石油醚結晶，得到通式(Ⅱ)所示化合物，

(b)將通式(Ⅱ)所示化合物溶于無水乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺和氯化鋅，上述兩者的用量均為通式(Ⅱ)所示化合物摩爾量的2.5倍當量，80～90℃回流15～26h，反應完畢，減壓去溶劑，加入純化水，用乙酸乙酯萃取，再減壓去溶劑，柱層析純化，得到通式(Ⅲ)所示化合物，

(c)將通式(Ⅲ)所示化合物溶于無水乙醇中，加入6mol/L的氫氧化鋰溶液至pH 值為10-11，室溫反應15～26h，加入純化水，用1M的稀鹽酸調pH 值至4～5，加入乙酸乙酯萃取2次；合并有機相，減壓去溶劑得產物通式(Ⅳ)所示的半抗原，

4.一種可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的人工抗原，其特征在于，是將權利要求1所示通式(Ⅳ)所示化合物和載體蛋白偶聯得到的偶聯物，其通式為：

其中n是1或3或5。

5.一種如權利要求4所述的可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的人工抗原的制備方法，其特征在于：

按以下比例進行操作：

(1)取權利要求1通式(Ⅳ)所示的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺中，攪拌充分后，加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，半抗原、碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺的重量比為5：4：3，室溫下攪拌4-8h，即可得到半抗原活化酯；通式(Ⅳ)為：

其中n是1或3或5；

(2)稱取載體蛋白，載體蛋白與半抗原的重量比為3：1，使其充分溶解在0.01mol/L的PBS中，在攪拌下將半抗原活化酯反應液逐滴緩慢滴加至載蛋白溶液中，并在室溫下攪拌16-24h；

(3)用0.01mol/L的PBS室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；

(4)分裝，于4℃保存備用。

6.根據權利要求5所述一種可共同用于檢測結晶紫和孔雀石綠的人工抗原的制備方法，其特征在于：

常用載體蛋白可采用牛血清白蛋白，卵清蛋白，人血清白蛋白和血藍蛋白中的任意一種。