[發明專利]二聚探針同時檢測櫻桃綠環斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201610016431.6
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105420415B
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 盧美光;高蕊;李世訪;梁穎博;麥合木提江·米吉提
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6811;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/94
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 高芬芳

本發明公開了二聚探針同時檢測櫻桃綠環斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法。本發明所提供的用于同時檢測櫻桃綠環斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒，包含如下用于合成cRNA二聚探針的特異性引物：CGRMV?F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；CGRMV?R：GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT；PLMVd?F：GGAATTCCTGTGATCCAGGTACCGCCGTAGAAACT；PLMVd?R：CTGGATCACACCCCCCTCGGAACCAACCGCT。本發明所制備的病毒和類病毒串聯的cRNA二聚探針，能同時檢測CGRMV和PLMVd，具有較好的靈敏性和特異性，可以一次檢測大量樣本，快速簡單，大大節約成本，適用于果樹田間樣品的CGRMV和PLMVd的快速檢測，有較大的應用潛力和實用價值。

技術領域

本發明涉及植物病毒檢測領域，具體涉及二聚探針同時檢測櫻桃綠環斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法。

背景技術

桃潛隱花葉類病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)屬于Avsunviroidae科，主要侵染桃樹、李、杏等核果類果樹。1997年，Hadidi等報道PLMVd在歐洲、亞洲、北美和南美的桃種質中廣泛分布(約為55％)(Hadidi,A,Giunchedi,L,Shamloul,AM,et al.,Occurrence of Peach latent mosaic viroid in stone fruits and its transmissionwith contaminated blades.Plant Disease,1997,81:154-158.)。PLMVd在桃樹上潛隱期可達5～7年，癥狀一般表現為花葉、延遲發芽，嚴重時引起早衰、甚至死亡(Desvignes GC.Peach latent mosaic and its relation to Peach yellow mosaic virusdisease.Acta Horticulture,1986,193:51-57)。據報道，在我國遼寧、山東、河北、陜西，四川，湖北等地樣品檢測到PLMVd，有的果園桃樹PLMVd發生普遍(張少瑜，張尊平，洪霓，等.桃潛隱花葉類病毒的鑒定.中國果樹，2000，(1)：30-31.；劉曉,Barba M,Broggio M,et al.,四川核果類果樹病毒類病害田間普查與檢測鑒定.西南農業學報，2004，17(5)：613-617.；徐文興，王國平，何云蔚，等.桃潛隱花葉類病毒中國分離株P3的克隆與序列分析.植物病理學報，2005，35(4)：300-304.；Yu,Y.,Zhao,Z.,Qin,L.,et al.,Incidence of major peachviruses and viroids in China.Journal of Plant Pathology,2013,95(3):603-607.)。櫻桃綠環斑駁病毒(Cherry green ring mottle virus，CGRMV)是李屬植物中發生較普遍，危害較嚴重的病毒之一。能侵染多種李屬植物包括甜櫻桃，酸櫻桃，櫻花，桃和杏(Zhang YP,Kirkpatrick B C,Smart C D,et al.cDNA cloning and molecular characterizationof Cherry green ring mottle virus.Journal of Gen Virol,1998,79:2275-2281.)。CGRMV屬于線形病毒科(Flxeviiridae)凹陷病毒屬(Foveavirus)(King A M Q,Adams M J,Carstens E B,et al.Virus taxonomy:classification and nomenclature of viruses:Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses.ElsevierAcademic Press,San Diego,2011.)，該病毒在北美、歐洲、新西蘭、非洲和亞洲等地區分布極廣。2011年我國首次利用RT-PCR檢測技術在甜櫻桃和桃等李屬植物中發現了CGRMV(ZhouJ F,Wang G P,Kuang R.F.,et al.First report of Cherry green ring mottle viruson cherry and peach grown in China.Plant Disease,2011,95(10):1319.)。王文文等(王文文，宗曉娟，陳立偉，等.山東地區櫻桃綠環斑駁病毒(CGRMV)的RT-PCR檢測及外殼蛋白基因的克隆.山東農業大學學報(自然科學版)，2012，43(2)：206-210，219.)對山東地區甜櫻桃生產園進行病原檢測，發現CGRMV發生較普遍。近年來，我們對我國主要桃產區病毒病進行了系統調查及RT-PCR分子檢測，結果表明:分別在新疆，甘肅，福建，河南，云南，廣西，河北，北京，山東等地桃樹樣品上均檢測到PLMVd；在山東、福建和甘肅等地桃樹樣品上檢測到CGRMV(Yu,Y.,Zhao,Z.,Qin,L.,et al.,Incidence of major peach viruses andviroids in China.Journal of Plant Pathology,2013,95(3):603-607.)。2013年6月我們對福建不同果園桃樹43個顯癥和不顯癥的樣品進行了6種主要病毒:蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)，李屬壞死環斑病毒(Prunus necroticringspot virus，PNRSV)，CGRMV，杏假褪綠葉斑病毒(APCLSV)，李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒(Plum bark necrosis stem pitting-associated virus，PBNSPaV)，白蝶蘭(屬)花葉病毒(Pecteilis mosaic virus，PcMV)，2種類病毒(PLMVd和啤酒花矮化類病毒(Hop stuntviroid，HSVd)檢測，43個樣品中只檢測到PLMVd，HSVd和CGRMV三種病原，而且，CGRMV主要是與PLMVd復合侵染為主，復合侵染率較高。