[發(fā)明專(zhuān)利]二聚探針同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類(lèi)病毒的斑點(diǎn)雜交試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610016431.6
• 申請(qǐng)日: 2016-01-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105420415B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧美光;高蕊;李世訪;梁穎博;麥合木提江·米吉提
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6811;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/94
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 高芬芳

1.二聚探針同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類(lèi)病毒的斑點(diǎn)雜交試劑盒，其特征在于：包含如下用于合成cRNA二聚探針的特異性引物：

CGRMV-F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；

CGRMV-R：GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT；

PLMVd-F：GGAATTCCTGTGATCCAGGTACCGCCGTAGAAACT；

PLMVd-R：CTGGATCACACCCCCCTCGGAACCAACCGCT。

2.同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類(lèi)病毒的cRNA二聚探針，其特征在于：所述cRNA二聚探針的序列如序列表中序列8所示。

3.同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類(lèi)病毒的cRNA二聚探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物CGRMV-F和CGRMV-R通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到所述櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收后克隆到質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒Ι；同時(shí)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物PLMVd-F和PLMVd-R通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到所述桃潛隱花葉類(lèi)病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收后克隆到質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒Π；

(2)對(duì)所述步驟(1)得到的所述重組質(zhì)粒Ι和重組質(zhì)粒Π分別使用權(quán)利要求1所述的特異性引物CGRMV-F和CGRMV-R及PLMVd-F和PLMVd-R通過(guò)RT-PCR進(jìn)行再次PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoI進(jìn)行酶切和串聯(lián)，亞克隆到新的質(zhì)粒載體上形成CGRMV和PLMVd串聯(lián)片段的重組質(zhì)粒Ⅲ；

(3)以所述步驟(2)合成的重組質(zhì)粒Ⅲ為模板，按照地高辛標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄制備得到CGRMV+PLMVd-cRNA二聚探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：

所述質(zhì)粒載體為pGEM-T載體；所述重組質(zhì)粒Ι為重組質(zhì)粒pG-CGRMV；所述重組質(zhì)粒Π為重組質(zhì)粒pG-PLMVd；所述重組質(zhì)粒Ⅲ為重組質(zhì)粒pG-CGRMV+PLMVd。

5.同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類(lèi)病毒的斑點(diǎn)雜交方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品的總RNA，得到RNA提取物；

(2)將所述RNA提取物經(jīng)甲醛變性后，點(diǎn)到雜交膜上；

(3)使用權(quán)利要求1所述的斑點(diǎn)雜交試劑盒或權(quán)利要求2所述的cRNA二聚探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：

所述步驟(1)中所述提取待測(cè)樣品的總RNA的方法為CTAB提取法；

所述步驟(2)中所述經(jīng)甲醛變性的方法為：5μlRNA加3μl 37％甲醛+2μl 20×SSC，混勻后于60℃保溫20min，置于冰上5min；

所述步驟(3)中所述雜交的溫度為60℃，雜交時(shí)間16h。

7.用于檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的斑點(diǎn)雜交試劑盒，其特征在于：包含如下用于合成cRNA單聚探針的特異性引物：

CGRMV-F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；

CGRMV-R：GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT。

8.檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的cRNA單聚探針，其特征在于：所述cRNA單聚探針的序列如序列表中序列5所示。