[發明專利]同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法

在審

• 申請號: 201610016285.7
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105543367A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 趙勇;肖莉莉;張昭寰;婁陽;杜蘇萍;潘迎捷
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63;C12R1/42
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

1.一種同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法，其特征在于，所述 方法包括如下步驟：

S1、將疊氮溴化丙錠母液加入待測的南美白對蝦蝦液勻漿中，獲得疊氮溴化 丙錠-樣品混合液；暗處理后曝光，高速離心，收集菌體；

S2、對所述菌體進行DNA提取；

S3、以提取得到的DNA為模板，以副溶血性弧菌的tlh基因和沙門氏菌的 orgC基因作為靶基因，進行多重熒光定量PCR擴增反應，輸出相應的循環閾值；

S4、將所述循環閾值分別與副溶血性弧菌標準曲線、沙門氏菌標準曲線進行 對照，獲得副溶血性弧菌和沙門氏菌的活菌濃度。

2.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S1中，所述疊氮溴化丙錠母液的制備包括：每1mg疊氮溴化 丙錠溶解于980μLddH₂O中獲得2mM的母液，并于-20℃下避光保存。

3.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S1中，所述南美白對蝦蝦液勻漿是在每225ml蛋白胨水中加 入25g生鮮南美白對蝦，均質處理2～5min而得。

4.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S1中，所述疊氮溴化丙錠-樣品混合液中疊氮溴化丙錠的濃度 為100μM，暗處理的時間為15～20min，曝光的時間為15～20min。

5.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S2中，所述提取是按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒的說 明書進行的。

6.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S3中，所述多重熒光定量PCR擴增反應采用的副溶血性弧菌 正引物的序列如SEQIDNO.1所示，副溶血性弧菌反引物的序列如SEQIDNO.2 所示，沙門氏菌正引物的序列如SEQIDNO.3所示，沙門氏菌反引物的序列如 SEQIDNO.4所示。

7.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S3中，所述多重熒光定量PCR擴增反應中，副溶血性弧菌探 針標記FAM作為報告基團，其序列如SEQIDNO.5所示；沙門氏菌探針標記HEX 作為報告基團，其序列如SEQIDNO.6所示。

8.根據權利要求1、6或7所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的 方法，其特征在于，所述多重熒光定量PCR擴增反應體系為每20μL，包括2μ L10×PCRBuffer、1.2μL濃度為50mM的MgSO₄溶液、0.5μL濃度為10mM 的dNTPsmix溶液、0.2μL濃度為5U/μL的TaqDNA聚合酶、0.5μL濃度 為10μM的副溶血性弧菌正引物和反引物、0.5μL濃度為10μM的沙門氏菌 正引物和反引物、0.2μL濃度為10μM的副溶血性弧菌探針、0.2μL濃度為 10μM的沙門氏菌探針、DNA模板1μL以及ddH₂O12.7μL。

9.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，所述多重熒光定量PCR擴增反應的條件為：95℃預變性2min，95℃ 變性15s，60℃退火1min，進行40個循環。

10.根據權利要求1所述的同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法， 其特征在于，步驟S4中，所述副溶血性弧菌標準曲線是以已知副溶血性弧菌活 菌濃度的南美白對蝦蝦液勻漿為對象，利用其菌落計數的結果和多重熒光定量 PCR輸出的Ct值構建的標準曲線；所述沙門氏菌標準曲線是以已知沙門氏菌活 菌濃度的南美白對蝦蝦液勻漿為對象，利用其菌落計數的結果和多重熒光定量 PCR輸出的Ct值構建的標準曲線。