[發明專利]同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法

在審

• 申請號: 201610016285.7
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105543367A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 趙勇;肖莉莉;張昭寰;婁陽;杜蘇萍;潘迎捷
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63;C12R1/42
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

技術領域

本發明涉及水產品中食源性致病菌的檢測方法，具體涉及一種同時定量南美 白對蝦中兩種致病菌活菌的方法。

背景技術

副溶血性弧菌和沙門氏菌是水產品中兩種重要的食源性致病菌，給公眾健康 造成了極大的安全隱患。在中國，副溶血性弧菌是水產品中頭號食源性致病菌， 因為消費生的或未煮熟的水產品極易感染副溶血性弧菌，從而造成嚴重的急性腸 胃炎，并伴隨有惡心、頭疼、低燒等癥狀。沙門氏菌是引起海產品食物中毒事件 發生的第二大食源性致病菌，每年約有20.8％的海產品食物中毒事件是由該菌引 起的。

南美白對蝦是南亞和東南亞部分地區最為重要的水產品，同時，因為其味道 鮮美、營養豐富，也是這些區域的最受歡迎的食品之一。但是，副溶血性弧菌和 沙門氏菌在對蝦中的檢出率逐年上升，已經成為生鮮對蝦食用安全的重要影響因 素。因此，構建一種快速、精準和高效的方法用于南美白對蝦中這兩種食源性致 病菌的定量檢測，對于水產品工業的健康發展和公眾衛生狀況的改善具有極為重 要的意義。

使用傳統方法定量檢測食品中的這兩種食源性致病，包括增菌富集、選擇性 培養基的分離以及生理生化鑒定等多個復雜的步驟，需要5～7天的時間。相比 于傳統方法，熒光定量PCR是一種更加快速、高效、省力的方法，已被廣泛應用 于食品中多種食源性致病菌的快速定量檢測。為了獲得更高的效率，不少研究構 建了多重熒光定量PCR的方法，該方法可同時定量檢測食品中兩種及兩種以上的 食源性致病菌。然而，無論是熒光定量PCR還是多重熒光定量PCR技術都存在一 個極大的缺陷，基于DNA的檢測方法無法區分樣品中的死、活菌，常導致假陽性 現象，從而過高估計了樣品中致病菌的數量。

疊氮溴化丙錠(Propidiummonoazide，PMA)是一種對核酸具有高度親和力 的光敏反應染料，能夠進入細菌的死細胞中，選擇性地交聯死菌的DNA，將其與 DNA擴增檢測技術相結合，可有效地抑制死菌細胞DNA的擴增。近年來，利用PMA 結合熒光定量PCR技術，已經廣泛應用于多種食源性致病菌的活菌檢測，例如副 溶血性弧菌、單增李斯特菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、大腸桿菌等重要的食源性 致病菌，被認為是目前最為有效的新型活菌檢測技術。然而，研究表明該新型活 菌檢測方法仍存在一定的技術難點，其區分死活菌的能力常受到多種因素的影 響，例如菌株、PMA濃度、暗處理時間、PCR擴增體系以及樣品基質等。因此， 目前將PMA與多重實時熒光PCR相結合的研究仍鮮少被報道，成為高通量活菌 定量檢測的熱點和難點問題。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，提供了一種同時定量南美 白對蝦中兩種致病菌活菌的方法。本發明旨在于構建一種新型快速的活菌定量技 術，結合PMA和多重熒光定量PCR的優點，同時定量檢測生鮮南美白對蝦中活的 副溶血性弧菌和沙門氏菌。這一方法創新地將多重熒光定量PCR技術和PMA染料 相結合，達到了快速定量南美白對蝦中兩種重要致病菌活菌的目的，以期提供一 種有效的技術支持用于改善水產品安全和保護公眾的健康。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明涉及一種同時定量南美白對蝦中兩種致病菌活菌的方法，所述方法包 括如下步驟：

S1、將疊氮溴化丙錠母液加入待測的南美白對蝦蝦液勻漿中，獲得疊氮溴化 丙錠-樣品混合液；暗處理后曝光，高速離心，收集菌體；

S2、對所述菌體進行DNA提取；

S3、以提取得到的DNA為模板，以副溶血性弧菌的t1h基因和沙門氏菌的 orgC基因作為靶基因，進行多重熒光定量PCR擴增反應，輸出相應的循環閾值；

S4、將所述循環閾值分別與副溶血性弧菌標準曲線、沙門氏菌標準曲線進行 對照，獲得副溶血性弧菌和沙門氏菌的活菌濃度。

優選的，步驟S1中，所述疊氮溴化丙錠母液的制備包括：每1mg疊氮溴化 丙錠溶解于980μLddH₂O中獲得2mM的母液，并于-20℃下避光保存。

優選的，步驟S1中，所述南美白對蝦蝦液勻漿是在每225ml蛋白胨水中加 入25g生鮮南美白對蝦，均質處理2～5min而得。