[發明專利]DNA甲基化分析中DNA樣本重亞硫酸鹽處理轉化率的評估方法

在審

• 申請號: 201610015862.0
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105441574A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 崔恒宓;劉洋洋
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及合成DNA甲基化檢測領域，主要是利用實時PCR評估重亞硫酸鹽處理DNA樣本后胞嘧啶轉化效率的方法。提供了DNA序列、引物序列及應用。

背景技術

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾，與動植物許多生命過程如生長、發育和分化相關，DNA甲基化異常也與人類許多疾病如腫瘤密切相關。研究和測定DNA甲基化已是生命科學研究中重要內容。在DNA甲基化研究中，重亞硫酸鹽處理DNA是一種最常見的檢測手段。重亞硫酸鹽能將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，再使用后續檢測手段檢測修飾。重亞硫酸鹽處理DNA的轉化效率決定了DNA甲基化檢測的準確性，未完全轉化的DNA會在隨后的檢測中導致錯誤的假陽性結果。因此，評估重亞硫酸鹽轉化DNA的效率是非常必要的。本研究提出一種簡單可行的檢測方法，通過SybrGreen評估重亞硫酸鹽的DNA的轉化效率。

發明內容

本發明的目的是建立評估重亞硫酸鹽處理DNA樣本后胞嘧啶轉化效率的有效方法，快速、方便和準確地檢測DNA樣本經重亞硫酸鹽轉化的效率。

本發明所述的方法能夠有效的評估包括人源在內任何物種來源的DNA樣品重亞硫酸鹽的轉化率，為提高DNA甲基化分析準確性提供有效方法。

在評估任何物種來源的DNA樣品重亞硫酸鹽的轉化率中，合成與任何物種無同源性的DNA與樣本混合并作為參考序列，并針對該序列按照上述方法建立轉化與未轉的DNA標準曲線，評估樣本的轉化效率。該方法具有更廣泛的應用價值，并有效地降低檢測成本。

本發明方法，包括以下步驟：

(1)設計并合成下列DNA標準品及引物：

1)標準品1：是指與任何已知物種無同源序列的DNA序列，該序列未經重亞硫酸鹽，也稱為未轉化的標準品；

2)標準品2：是指標準品1中未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶后的序列；也稱為轉化的標準品；

3)引物1：是指根據標準品1的序列設計的用于擴增標準品1的檢測引物；

4)引物2：是指根據標準品2的序列設計的用于擴增標準品2的檢測引物；

(2)使用所述引物1和引物2，以所述標準品1與標準品2按照梯度稀釋為模板，分別做標準曲線，其中標準曲線以模板的拷貝數CN對應相應的Ct值；

(3)將標準品1加入到待檢測DNA樣本中，

(4)將含有標準品1的待檢測DNA樣本使用重亞硫酸鹽進行轉化；

(5)使用引物1和引物2，以步驟(4)處理后的DNA樣本為模板，分別檢測樣本中標準品1與標準品2的Ct值；再根據步驟(2)中的標準曲線，計算出樣本中標準品1與標準品2相應的拷貝數；

(6)使用計算公式：重亞硫酸鹽處理DNA轉化率(％)＝標準品2的拷貝數/(標準品1拷貝數+標準品2拷貝數)×100％，計算轉化率。

本發明所述的方法適用于包括人源在內的任何物種基因組的重亞硫酸鹽轉化效率的檢測應用。所述的標準1和標準品2是人工合成與任何物種無同源性的DNA序列,作為一個具體的實例，標準品1的序列如SEQIDNO.1所示，標準品2的序列如SEQIDNO.2所示；但并不限于此。標準1和標準品2的引物，本領域技術人員可以根據其具體序列進行設計并合成。

由于實時PCR的高度特異性和靈敏性，該方法可以檢測極低的未轉化完全的DNA樣本。為了評估方法的準確性，分別應用兩種方法檢測5組比例按不同混合的DNA模板，結果表明該方法十分可靠。

本發明分別以梯度稀釋的重亞硫酸鹽處理和未處理DNA標準品轉化與未轉化的DNA的Ct值以及對應的DNA拷貝數的標準曲線。設計人工合成與任何物種無同源性的序列作為樣本的參考序列，使用SybrGreen法應用上述方法評估所有物種重亞硫酸鹽處理樣本的轉化效率，并對該檢測方法進行可靠性評估，結果顯示，該方法能夠有效地評估DNA樣品重亞硫酸鹽的轉化效率，為廣泛物種DNA甲基化準確分析提供了可靠快捷的方法。

附圖說明

圖1.不同的引物分別檢測待測樣本中轉化的和未轉化的DNA模板，下劃線標注的堿基分別代表轉化與未轉化組堿基差異的位置。

圖2.精確測定重亞硫酸鹽處理DNA轉化效率的原理。基因組DNA分別經重亞硫酸鹽處理與未經重亞硫酸鹽處理，兩組模板分別使用不同的實時PCR引物進行相應的檢測。