[發(fā)明專利]一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標(biāo)記gga-miR-1416-5p及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610015294.4
• 申請(qǐng)日: 2016-01-11
• 公開（公告）號(hào): CN105462982A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李顯耀;吳桂賢;劉麗英;劉肖意
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標(biāo)記gga-miR-1416-5p及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)為革蘭氏陰性菌，是世界公認(rèn)的食源性致病菌之一，不僅對(duì)蛋雞生產(chǎn)造成重大影響，而且它能通過家禽副產(chǎn)品給人類的健康帶來很大的威脅。這種病菌主要是通過動(dòng)物性產(chǎn)品包括禽肉，雞蛋和奶類及奶制品等導(dǎo)致人中毒甚至死亡。因此如何獲得抗性高的遺傳個(gè)體成為亟待解決的問題之一。

小RNA(miRNA)是一類長度約22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，與靶基因3'UTR(非翻譯區(qū))結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)發(fā)育、脂肪代謝等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長期研究和探索，提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法，該抗性分子標(biāo)記為雞miRNAgga-miR-1416-5p，發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-1416-5p可以通過調(diào)控TLR21基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙門氏菌對(duì)雞的感染，因此gga-miR-1416-5p可以作為腸炎沙門氏菌感染抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記，發(fā)明人進(jìn)一步提供了其檢測(cè)方法，從而為雞的抗病遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：

發(fā)明人首先提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性性狀的分子標(biāo)記，該抗性分子標(biāo)記為雞miRNAgga-miR-1416-5p，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；

發(fā)明人進(jìn)一步給出了該分子標(biāo)記的檢測(cè)方法如下：

gga-miR-1416-5p的表達(dá)量檢測(cè)

miRNA反轉(zhuǎn)錄

用OneStepmiRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime)試劑盒，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系為20μL(具體見表1)。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃，60min；85℃，5s；反應(yīng)完成后獲得的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

表1miRNA反轉(zhuǎn)錄體系(20μL)

其中所述的盲腸總RNA為雞盲腸總RNA，采用常規(guī)方法獲得，

gga-miR-1416-5p熒光定量PCR

根據(jù)gga-miR-1416-5p成熟序列設(shè)計(jì)引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。利用所設(shè)引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTMmiRNART-PCRKit說明書，在StratageneMX3000P熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表3所示。

表2miRNA定量檢測(cè)引物

其中>gga-miR-1416-5p和U6分別作為ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCRPrimer選用試劑盒中自帶引物；

熒光定量PCR反應(yīng)程序采用兩步法：95℃預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán)；95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；最后添加溶解曲線(95℃1min，62℃30s，95℃30s)，1個(gè)循環(huán)，每個(gè)cDNA樣品重復(fù)三次。以U6作為內(nèi)參基因，用2^-ΔΔCt方法來計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，用SAS8.1軟件中單因素方差分析對(duì)miRNA表達(dá)量差異進(jìn)行分析。

表3熒光定量PCR體系(20μL)

發(fā)明人為了驗(yàn)證上述gga-miR-1416-5p的功能采用了靶基因檢測(cè)的方式，利用TargetScan及miRanda等軟件預(yù)測(cè)到TLR21是gga-miR-1416-5p的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過分別比較腸炎沙門氏菌感染組與未感染組中miRNA與靶基因的調(diào)控方向，可知gga-miR-1416-5p在感染組中顯著上調(diào)，靶基因TLR21在感染組中的表達(dá)量顯著低于未感染組(如圖1所示)，即gga-miR-1416-5p與TLR21調(diào)控方向相反，表現(xiàn)出相互作用關(guān)系,與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。說明gga-miR-1416-5p可以通過調(diào)控TLR21基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙門氏菌對(duì)雞的感染。因此gga-miR-1416-5p可以作為腸炎沙門氏菌感染抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記。