[發(fā)明專利]一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610014145.6
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105420229B
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李志遠;馬文波;鄧思浩;李彩月;陳旦;劉亮
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

本發(fā)明公開了一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。所述裂解液配方：pH8.5Tris?HCl，10mM；EDTA，10?15mM；SDS，1.0?1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3?0.5mg/ml。通過將SDS、EDTA和蛋白酶K的組分分別提高，可明顯提高新裂解液對骨組織的裂解程度。同時在使用時再利用去蛋白液，DNA漂洗液處理，以及DNA離心柱法可明顯減少DNA樣品中的雜質(zhì)成分，有利于提高PCR的擴增效果，從而有助于獲取高純度古代生物骨骼的DNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。

背景技術(shù)

從古代生物骨骼中提取DNA對于探索古代生物的生命奧秘以及人類文明的發(fā)展具有重要意義。骨骼是一種比較特殊的生物檢測材料，因為外部有堅硬的保護組織，所以相對于生物體的其他組織臟器器官的降解比較慢。因此，對于高度腐化的樣本來說，骨骼是進行DNA檢測的有效檢測材料之一。由于受周圍環(huán)境中核酸酶和微生物的作用，古代生物骨骼中的DNA鏈會發(fā)生斷裂、缺失甚至降解，不易獲得足夠的DNA樣本。因此，目前尚需尋找一種更有效的DNA提取方法，為最大程度地提取和保存陳舊骨骼中的DNA。

由于骨骼組織異常堅固，提取DNA較其他軟組織困難。而現(xiàn)有的一些舊方法存在組織裂解不完全，DNA丟失較多，同時獲取的樣本含雜質(zhì)太多，苯酚/氯仿法對人體毒性大，即便脫鈣法也存在占用時間太長等缺點。本發(fā)明提供了一種新的骨組織DNA提取液，無需脫鈣處理和利用苯酚/氯仿，通過提高舊方法裂解液中SDS、EDTA和蛋白酶K的組分，增強裂解液對骨組織的裂解程度，使骨組織裂解更充分。骨骼裂解離心后，再將上清液利用異丙醇、去蛋白液，DNA漂洗液等處理，借助離心柱可更大程度地獲取高純度古代生物骨骼的DNA。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。該裂解液及配套使用的方法能夠使得組織裂解完全，獲取的樣本雜質(zhì)少，更大程度地獲取高純度古代生物骨骼的DNA，而且使用環(huán)境無毒、操作簡便，時間短、效率高。

一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液，所述裂解液配方是在去離子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。

所述裂解液優(yōu)選配方是在去離子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。

利用所述的裂解液提取古代生物骨骼DNA的方法，包括以下步驟：

1)剪取一小塊出土的古代人骨骼，將其碾碎，稱取0.3-0.4g放入1.5ml的EP管中；

2)加入250-300μl的裂解液，55-57℃孵育12–16h；

3)12000rpm離心10-15min，取200-250μl上清液入新EP管，按照體積比1:1加入250μl異丙醇，輕輕混勻后4℃靜置至少10min；

4)輕輕吹打混合液，并將混合液轉(zhuǎn)移至離心柱，12000rpm離心1-2min，棄收集管內(nèi)的液體；

5)加入500μl去蛋白液，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液；

6)加入600μl的漂洗液，12000rpm離心1min，棄收集管內(nèi)廢液，并重復一次操作，本步驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇；

7)打開蓋子，24-26℃至少風干10–15min；

8)加入75℃預熱的去離子水30-50μl洗脫DNA；

9)將收集的DNA液加入離心柱內(nèi)，相同條件下再次洗脫。