[發(fā)明專利]一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610014145.6 | 申請日： | 2016-01-08 |
| 公開（公告）號： | CN105420229B | 公開（公告）日： | 2018-07-17 |
| 發(fā)明（設計）人： | 李志遠;馬文波;鄧思浩;李彩月;陳旦;劉亮 | 申請（專利權）人： | 中南大學 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 長沙市融智專利事務所 43114 | 代理人： | 袁靖 |
| 地址： | 410083 湖南*** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 裂解液 骨骼 蛋白酶K 擴增效果 去蛋白液 高純度 離心柱 漂洗液 再利用 對骨 裂解 配方 | ||
1.一種提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)剪取一小塊出土的古代人骨骼，將其碾碎，稱取0.3-0.4g放入1.5ml的EP管中；
2)加入250-300μl的裂解液，55-57℃孵育12–16h；
3)12000rpm離心10-15min，取200-250μl上清液入新EP管，按照體積比1:1加入250μl異丙醇，輕輕混勻后4℃靜置至少10min；
4)輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心1-2min，棄收集管內的液體；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液，并重復一次操作，本步驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇；
7)打開蓋子，24-26℃至少風干10–15min；
8)加入75℃預熱的去離子水30-50μl洗脫DNA；
9)將收集的DNA液加入離心柱內，相同條件下再次洗脫；
所述裂解液配方是在去離子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。
2.根據(jù)權利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，所述裂解液配方是在去離子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)剪取一小塊出土的古代人骨骼，將其碾碎，稱取0.3g放入1.5ml的EP管中；
2)加入300μl的裂解液，55℃孵育12–16h；
3)12000rpm離心10min，取250μl上清液入新EP管，按照體積比1:1加入250μl異丙醇，輕輕混勻后4℃靜置至少10min；
4)輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心1min，棄收集管內的液體；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液，并重復一次操作，本步驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇；
7)打開蓋子，25℃至少風干10–15min；
8)加入75℃預熱的去離子水50μl洗脫DNA；
9)將收集的DNA液加入離心柱內，相同條件下再次洗脫。
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