[發(fā)明專利]分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610013868.4
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105651888A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 馬慶旭;吳良歡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發(fā)明屬于土壤科學領域，涉及植物營養(yǎng)學及植物生理學研究方法，尤其涉及一種分析 環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法。

背景技術

自從1840年李比希(Liebig)創(chuàng)立了“植物礦質營養(yǎng)學說”起，大多數的研究都針對無機氮 展開，而有機營養(yǎng)的研究而相對落后。近十年的研究表明，大多數植物具備吸收氨基酸、多 肽、核酸，甚至大分子蛋白質的能力。盡管植物可以吸收有機氮已經成為共識，但自然環(huán)境 下土壤氨基酸周轉迅速，因此自然環(huán)境下氨基酸的營養(yǎng)貢獻仍沒有定論。Lipson等根據植物- 微生物競爭吸收的模型，計算出氨基酸對高山植物的營養(yǎng)貢獻率不低于50％。然而，在亞熱 帶地區(qū)，根據¹³C,¹⁵N雙標記技術研究得出其營養(yǎng)貢獻率低于1％。從不同地區(qū)氨基酸營養(yǎng)貢獻 的差異可以看出，環(huán)境條件對氨基酸營養(yǎng)貢獻具有重要的作用。

環(huán)境因子包括溫度、光照強度、二氧化碳濃度、土壤氮素組成及含量、土壤酸度、土壤 結構、土壤污染物組成及濃度等，這些因子會對氨基酸營養(yǎng)貢獻產生較大的影響。這些因素 不止影響土壤中氨基酸的生物有效性，還會對植物根系吸收、根系到地上部的轉運、根系及 地上部氨基酸的代謝等產生較大的影響。然而，關于該方面的研究及研究方法相對缺乏，缺 少系統(tǒng)準確的測定影響作用的方法，尤其是從植物營養(yǎng)和植物生理角度綜合分析環(huán)境因素對 氨基酸營養(yǎng)代謝的影響。

發(fā)明內容

本發(fā)明旨在解決研究環(huán)境因素對氨基酸吸收代謝影響方法缺乏的問題，提供一種分析環(huán) 境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法，是一種采用同位素示蹤技術及氣相色譜-同位素質譜 聯用技術，分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法。

本發(fā)明方法通過以下步驟實現：

1.環(huán)境因子對氨基酸長期吸收的影響

采用無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法：以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液 中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生 長狀態(tài)一致的植物，更換為3mM5-55％¹⁵N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格 蘭營養(yǎng)液配方，設置相應的環(huán)境條件，如光照強度、營養(yǎng)液pH、CO₂濃度等，每2-3d更換一 次營養(yǎng)液，培養(yǎng)6-25d后破壞性采樣，將植物根系與地上部分開，根系于清水中清洗三次，接 著放置于超聲波清洗機中清洗1分鐘，采用0.5M氯化鈣溶液清洗三次，最后用純凈水沖洗三次， 以去除吸附于根系上的¹⁵N，采用冷凍干燥或者烘箱烘干后，將根系和地上部一起放于球磨儀 中粉碎，采用同位素質譜分析不同環(huán)境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根據此 步驟可以分析環(huán)境因素對植物生長及氨基酸吸收的長期影響；

2.環(huán)境因子對氨基酸短期吸收及吸收方式的影響

采用如步驟1所述的培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng) 液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇 生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水多次沖洗根系及離心管后，將植物放置于清水中8-10h， 之后將其根系放置于50μmolL^-1CCCP溶液中1小時，使其根系失活，然后以不用CCCP處理的 幼苗做對照，將植物放置于含3mM98.10at.％¹⁵N-甘氨酸的營養(yǎng)液中，營養(yǎng)液中除氮外其它 元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，進行標記氨基酸的短期吸收及吸收方式試驗，設置相應的 環(huán)境條件，如光照強度、營養(yǎng)液pH、CO₂濃度等，培養(yǎng)2-6h后破壞性采樣，將植物根系與地 上部分開，根系放于清水中清洗三次，接著放置于超聲波清洗機中清洗1分鐘，采用0.5M氯化 鈣溶液清洗三次，最后用純凈水沖洗三次，以去除吸附于根系上的¹⁵N，采用冷凍干燥或者烘 箱烘干后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質譜分析不同環(huán)境條件下處 理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根據步驟1的結果，可以確定環(huán)境因子對甘氨酸吸收的長 期效應，即對吸收和后續(xù)代謝的影響，而根據步驟2的短期吸收結果，可以分析環(huán)境因素對根 系吸收及吸收方式的影響，進而推測影響甘氨酸營養(yǎng)貢獻的限速步驟。

3.環(huán)境因子對氨基酸在植物體內代謝的影響