[發明專利]分析環境因素影響氨基酸營養貢獻機理的方法

在審

• 申請號: 201610013868.4
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105651888A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 馬慶旭;吳良歡
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種分析環境因素影響氨基酸營養貢獻機理的方法，其特征在于，通過以下步驟實現：

(1)環境因子對氨基酸長期吸收的影響

采用無菌營養液培養方法：以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養液 中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養液配方，在50ml離心管中培養植物15-25d后，選擇生 長狀態一致的植物，更換為3mM5-55％¹⁵N-甘氨酸為氮源，營養液中其它元素含量參照霍格 蘭營養液配方，設置光照強度、營養液pH、CO₂濃度相應的環境條件，每2-3d更換一次營養 液，培養6-25d后破壞性采樣，將植物根系與地上部分開，去除吸附于根系上的¹⁵N，清洗根 系，接著放置于超聲波清洗機中清洗，再用0.5M氯化鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，干燥 后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質譜分析不同環境條件下處理的植 物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析環境因素對植物生長及氨基酸吸收的長期影響；

(2)環境因子對氨基酸短期吸收及吸收方式的影響

采用步驟(1)所述的無菌營養液培養方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸 為氮源，營養液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養液配方，在50ml離心管中培養植物 15-25d后，選擇生長狀態一致的植物，采用滅菌純凈水沖洗根系及離心管后，將植物放置于 清水中8-10h，之后將其根系放置于50μmolL^-1CCCP溶液中1小時，使其根系失活，然后以不 用CCCP處理的幼苗做對照，將植物放置于含3mM98.10at.％¹⁵N-甘氨酸的營養液中，營養液 中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養液配方，進行標記氨基酸的短期吸收及吸收方式試驗， 設置光照強度、營養液pH、CO₂濃度相應的環境條件，培養2-6h后破壞性采樣，將植物根系 與地上部分開，根系放于清水中清洗，接著放置于超聲波清洗機中清洗，再用0.5M氯化鈣溶 液清洗，最后用純凈水沖洗，以去除吸附于根系上的¹⁵N，干燥后，將根系和地上部一起放于 球磨儀中粉碎，采用同位素質譜分析不同環境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量， 分析環境因素對根系吸收及吸收方式的影響，進而分析影響甘氨酸營養貢獻的限速步驟；

(3)環境因子對氨基酸在植物體內代謝的影響

采用步驟(1)所述的無菌營養液培養方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨 酸為氮源，營養液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養液配方，在50ml離心管中培養植物 15-25d后，選擇生長狀態一致的植物，采用滅菌純凈水沖洗根系及離心管后，將植物放置于 清水中8-24h，之后更換為3mM50-99.8％¹⁵N-甘氨酸為氮源，營養液中其它元素含量參照霍 格蘭營養液配方，設置相應的環境條件，如光照強度、營養液pH、CO₂濃度等，培養10-24h 后破壞性采樣，將植物根系于清水中清洗，接著放置于超聲波清洗機中清洗，再用0.5M氯化 鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，以去除吸附于根系上的¹⁵N，干燥后，將根系和植物地上部 一起放于球磨儀中粉碎；稱取20mg經干燥后粉碎的植物樣品，加4ml80％乙醇放置于震蕩 機中以10-30r/min震蕩提取1h，提取液在3500-4500g/min離心15min，保留上清液，殘渣用 1ml80％乙醇再提取1h，10000-12000g離心5-15min，兩次離心的上清液混合，采用N₂吹干 或者低溫低壓旋轉蒸發儀于25-35℃下蒸干，再次用2ml0.1mol/LHCl溶解，在 10000-15000r/min轉速下離心10-15min，上清液傾倒于體積為2cm³的陽離子交換柱中，該陽 離子交換柱采用20ml超純水清洗，其中的氨基酸采用20ml4mol/LNH₄OH洗脫，洗脫液氮 吹過夜，去除其中的NH₃，之后冷凍干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就轉變為相應的叔丁 基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸濃度及¹⁵N豐度采用氣相色譜-同位素質譜聯用儀進行 測定。