[發(fā)明專利]分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610013868.4
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105651888A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 馬慶旭;吳良歡
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種分析環(huán)境因素影響氨基酸營養(yǎng)貢獻機理的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)：

(1)環(huán)境因子對氨基酸長期吸收的影響

采用無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法：以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液 中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物15-25d后，選擇生 長狀態(tài)一致的植物，更換為3mM5-55％¹⁵N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍格 蘭營養(yǎng)液配方，設置光照強度、營養(yǎng)液pH、CO₂濃度相應的環(huán)境條件，每2-3d更換一次營養(yǎng) 液，培養(yǎng)6-25d后破壞性采樣，將植物根系與地上部分開，去除吸附于根系上的¹⁵N，清洗根 系，接著放置于超聲波清洗機中清洗，再用0.5M氯化鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，干燥 后，將根系和地上部一起放于球磨儀中粉碎，采用同位素質(zhì)譜分析不同環(huán)境條件下處理的植 物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析環(huán)境因素對植物生長及氨基酸吸收的長期影響；

(2)環(huán)境因子對氨基酸短期吸收及吸收方式的影響

采用步驟(1)所述的無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨酸 為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物 15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水沖洗根系及離心管后，將植物放置于 清水中8-10h，之后將其根系放置于50μmolL^-1CCCP溶液中1小時，使其根系失活，然后以不 用CCCP處理的幼苗做對照，將植物放置于含3mM98.10at.％¹⁵N-甘氨酸的營養(yǎng)液中，營養(yǎng)液 中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，進行標記氨基酸的短期吸收及吸收方式試驗， 設置光照強度、營養(yǎng)液pH、CO₂濃度相應的環(huán)境條件，培養(yǎng)2-6h后破壞性采樣，將植物根系 與地上部分開，根系放于清水中清洗，接著放置于超聲波清洗機中清洗，再用0.5M氯化鈣溶 液清洗，最后用純凈水沖洗，以去除吸附于根系上的¹⁵N，干燥后，將根系和地上部一起放于 球磨儀中粉碎，采用同位素質(zhì)譜分析不同環(huán)境條件下處理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量， 分析環(huán)境因素對根系吸收及吸收方式的影響，進而分析影響甘氨酸營養(yǎng)貢獻的限速步驟；

(3)環(huán)境因子對氨基酸在植物體內(nèi)代謝的影響

采用步驟(1)所述的無菌營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，以2mM硝酸鈉+0.5mM硫酸銨+0.5mM甘氨 酸為氮源，營養(yǎng)液中除氮外其它元素含量參照霍格蘭營養(yǎng)液配方，在50ml離心管中培養(yǎng)植物 15-25d后，選擇生長狀態(tài)一致的植物，采用滅菌純凈水沖洗根系及離心管后，將植物放置于 清水中8-24h，之后更換為3mM50-99.8％¹⁵N-甘氨酸為氮源，營養(yǎng)液中其它元素含量參照霍 格蘭營養(yǎng)液配方，設置相應的環(huán)境條件，如光照強度、營養(yǎng)液pH、CO₂濃度等，培養(yǎng)10-24h 后破壞性采樣，將植物根系于清水中清洗，接著放置于超聲波清洗機中清洗，再用0.5M氯化 鈣溶液清洗，最后用純凈水沖洗，以去除吸附于根系上的¹⁵N，干燥后，將根系和植物地上部 一起放于球磨儀中粉碎；稱取20mg經(jīng)干燥后粉碎的植物樣品，加4ml80％乙醇放置于震蕩 機中以10-30r/min震蕩提取1h，提取液在3500-4500g/min離心15min，保留上清液，殘渣用 1ml80％乙醇再提取1h，10000-12000g離心5-15min，兩次離心的上清液混合，采用N₂吹干 或者低溫低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于25-35℃下蒸干，再次用2ml0.1mol/LHCl溶解，在 10000-15000r/min轉(zhuǎn)速下離心10-15min，上清液傾倒于體積為2cm³的陽離子交換柱中，該陽 離子交換柱采用20ml超純水清洗，其中的氨基酸采用20ml4mol/LNH₄OH洗脫，洗脫液氮 吹過夜，去除其中的NH₃，之后冷凍干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳氖宥? 基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸濃度及¹⁵N豐度采用氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀進行 測定。