[發(fā)明專利]一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610013182.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN105441382A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡安斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法。

背景技術(shù)

既往胚胎干細(xì)胞分化中的細(xì)胞分選需要利用胰酶消化細(xì)胞并離心吹打等，造成細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，不利于細(xì)胞移植應(yīng)用。因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞向肝細(xì)胞分化時(shí)，胚胎干細(xì)胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(embryonicbody，EB)，這相當(dāng)于體內(nèi)胚胎的囊胚，然后擬胚體再貼壁生長并向肝細(xì)胞方向分化。每個(gè)擬胚體包含大量細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞之間以及其與培養(yǎng)瓶底部緊密連接，甚至難以分清細(xì)胞界限。如果需要將陽性細(xì)胞分選，就需要用胰酶消化細(xì)胞，使各個(gè)細(xì)胞之間以及與培養(yǎng)瓶底部之間分離，再用抗體標(biāo)記細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀(FCM)或磁珠分選將所需要的陽性細(xì)胞分選出來。這種分選方法經(jīng)過胰酶的消化和FCM等機(jī)器分選操作，嚴(yán)重影響細(xì)胞活力，細(xì)胞生長狀態(tài)明顯變差，很難完成后續(xù)的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。

如何在不影響細(xì)胞活力的前提下，將胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞初步分選出來并在新的培養(yǎng)系統(tǒng)中再培養(yǎng)，以提高其分化純度，用于后續(xù)的肝細(xì)胞移植是當(dāng)前的難題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，包含如下步驟：

(1)胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ESC)在擬胚體(embryonicbody，EB)液體培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)開始分化，得到擬胚體；

(2)將步驟(1)得到的擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每個(gè)擬胚體以貼壁點(diǎn)為中心向四周輻射分化生長形成細(xì)胞分化群落；胚胎干細(xì)胞分化至第15d時(shí)，刮取位于細(xì)胞分化群落區(qū)域1和/或細(xì)胞分化群落區(qū)域2的正常生長狀態(tài)細(xì)胞，將其再次貼壁培養(yǎng)，得到胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞；

步驟(1)中所述的胚胎干細(xì)胞優(yōu)選為BALB/c系小鼠胚胎干細(xì)胞；

步驟(2)中所述的區(qū)域1為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的1/4；

步驟(2)中所述的區(qū)域1優(yōu)選為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的1/5；

步驟(2)中所述的區(qū)域2為細(xì)胞分化群落區(qū)域3之外的區(qū)域；

所述的區(qū)域3為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的3/4；

所述的區(qū)域3優(yōu)選為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的4/5；

步驟(1)中所述的搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的目的在于：使細(xì)胞在培養(yǎng)液中處于懸浮狀態(tài)，避免貼壁，以利于其分化發(fā)育為圓球形的擬胚體；

步驟(1)中所述的擬胚體液體培養(yǎng)基優(yōu)選由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成；

所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基；所述的添加物包含如下組分：體積分?jǐn)?shù)為20％的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100μg/mL的鏈霉素；

步驟(1)中所述的搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為培養(yǎng)6天；

步驟(2)中所述的貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成；

所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基；所述的添加物包含如下組分：體積分?jǐn)?shù)為20％的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100μg/mL的鏈霉素；

步驟(2)中所述的貼壁培養(yǎng)過程中添加肝性生長因子；

所述的肝性生長因子為EGF、TGF、HGF、OSM、地塞米松、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白中的至少一種；

所述的肝性生長因子加入時(shí)間和用量優(yōu)選為：

胚胎干細(xì)胞分化第7天～19天(本發(fā)明中的分化天數(shù)是從胚胎干細(xì)胞首次分化開始計(jì))，加入終濃度為30ng/mL的EGF和終濃度為30ng/mL的TGF；

胚胎干細(xì)胞分化第7天～10天，加入終濃度為20ng/mL的HGF；

胚胎干細(xì)胞分化第11～19天，終濃度為40ng/mL的HGF；