[發明專利]一種胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法

在審

• 申請號: 201610013182.5
• 申請日: 2016-01-06
• 公開（公告）號: CN105441382A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 胡安斌
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

1.一種胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于包含如下步驟：

(1)胚胎干細胞在擬胚體液體培養基中搖動培養或懸浮培養開始分化，得到擬胚體；

(2)將步驟(1)得到的擬胚體進行貼壁培養，每個擬胚體以貼壁點為中心向四周輻射分化生長形成細胞分化群落；胚胎干細胞分化至第15d時，刮取位于細胞分化群落區域1和/或細胞分化群落區域2的正常生長狀態細胞，將其再次貼壁培養，得到胚胎干細胞分化的肝細胞；

步驟(2)中所述的區域1為位于細胞分化群落中心區域且其邊緣至細胞分化群落中心的距離不超過細胞分化群落半徑的1/4；

步驟(2)中所述的區域2為細胞分化群落區域3之外的區域；

所述的區域3為位于細胞分化群落中心區域且其邊緣至細胞分化群落中心的距離為細胞分化群落半徑的3/4。

2.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的貼壁培養過程中添加肝性生長因子。

3.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

所述的肝性生長因子為EGF、TGF、HGF、OSM、地塞米松、胰島素和轉鐵蛋白中的至少一種。

4.根據權利要求2或3所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

所述的肝性生長因子加入時間和用量為：

胚胎干細胞分化第7天～19天，加入終濃度為30ng/mL的EGF和終濃度為30ng/mL的TGF；

胚胎干細胞分化第7天～10天，加入終濃度為20ng/mL的HGF；

胚胎干細胞分化第11～19天，終濃度為40ng/mL的HGF；

胚胎干細胞分化第15～19天，加入終濃度為10ng/mL的OSM、終濃度為10^-7M的地塞米松、終濃度為5μg/mL的胰島素和終濃度為5μg/mL的轉鐵蛋白。

5.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的胚胎干細胞為BALB/c系小鼠胚胎干細胞。

6.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的區域1為位于細胞分化群落中心區域且其邊緣至細胞分化群落中心的距離不超過細胞分化群落半徑的1/5；

所述的區域3為位于細胞分化群落中心區域且其邊緣至細胞分化群落中心的距離為細胞分化群落半徑的4/5。

7.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的擬胚體液體培養基由基礎培養基和添加物組成；

所述的基礎培養基為DMEM培養基；所述的添加物包含如下組分：體積分數為20％的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100μg/mL的鏈霉素。

8.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的搖動培養或懸浮培養的時間為培養6天。

9.根據權利要求1所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的貼壁培養的培養基由基礎培養基和添加物組成；

所述的基礎培養基為DMEM培養基；所述的添加物包含如下組分：體積分數為20％的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100μg/mL的鏈霉素。

10.權利要求1～9任一項所述的胚胎干細胞分化的肝細胞的分選方法在細胞培養技術領域中的應用。