[發明專利]一種胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因及其應用

在審

• 申請號: 201610012793.8
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105505959A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 程劍松;宋其濤;王鵬
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C07K1/107
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于分子生物學中糖工程領域，涉及胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因的第 1405和1406位核苷酸的特異性突變，多肽及蛋白快速簡易葡萄糖基化的酶合成方法。

背景技術

胸膜肺炎放線桿菌在1957年首次報道,早稱為副溶血嗜血桿菌，1964年被正式宣 布為豬胸膜肺炎的病原體，1983年重新分類后，DNA的研究顯示它與林氏放線桿菌更密切相 關。屬于巴氏桿菌科，放線菌屬，是一種革蘭氏陰性多形態小球桿菌，兼性厭氧，有莢膜，鞭 毛和菌毛，不能形成芽孢，是一種呼吸道寄生菌，主要存在于患病動物的肺部和扁桃體，病 豬和帶菌豬是本病的主要傳染源。

糖蛋白在生命活動中扮演著重要的角色,如細胞信號識別、神經調控、細胞間的信 息傳達及免疫調節等,因此引起了人們的廣泛關注。糖肽是位于糖蛋白核心結構區域的由 糖基與氨基酸或多肽鏈以共價鍵相連而形成的綴合物。含有糖肽的物質與糖蛋白相比,具 有多種相似的重要生物功能,同時又沒有糖蛋白巨大的分子量和復雜的結構,因此成為研 究糖蛋白的重要模型。而且糖肽類藥物研究非常廣泛，糖肽類藥物主要用于治療癌癥、代謝 紊亂相關的重大疾病，這些疾病相關的藥物擁有全球非常重要的市場。蛋白糖基化修飾一 共有5種類型，按重要性排序分別是N－O－P－C－和G－糖基化，這些糖基化修飾均通過 連接寡糖基團到蛋白表面，但其修飾位點不同，其中以N-糖基化最為普遍，其通過將聚糖連 接到天冬氨酸或精氨酸側鏈的氮原子上對蛋白進行修飾，是目前研究的最為透徹的糖基化 過程。

一直以來，大部分藥物糖蛋白依賴于直接從生物體中提取，但因為數量有限成本 高昂存在病毒感染等問題，無法廣泛運用于臨床。因此，目前的研究主要集中在開發糖蛋白 表達載體，經過適當的糖基化改造，用于藥用蛋白質的生產。ApNGT就屬于N-糖基化修飾的 一種重要的轉移酶。

發明內容

本發明公開了一種胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因，其特征在于，所述ApNGT突變 基因的突變位點在于所述ApNGT基因從5′端起第1405個核苷酸，突變結果為C到G,第1406 個核苷酸，突變結果為A到C，所述的ApNGT基因序列見SEQNO:1。其編碼的氨基酸突變位點 第620個氨基酸，突變結果是由Glutamine到Alanine，序列見SEQNO:2。

本發明所述胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因，其中的引物SEQNO:3 CATTTCCATTTTGCATTGGGGGCATCAAACGGTATTAC為特異擴增胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因 的上游引物；SEQNO:4GCCCCCAATGCAAAATGGAAATGCACTTTCACTTTG為胸膜肺炎放線桿菌的 ApNGT基因的下游引物。

本發明所述胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因，其中1）包含N-X-S/T序列的多肽進行 糖基化修飾，反應為體系30ul，包含pH=8.0Tris-HCl(50mM),MgCl₂(5mM),UDP-Glc(10mM), NaCl(10mM),ApNGT(0.3mg/ml),Peptide(1mM),用ddH₂O補齊，37℃水浴條件下反應45分 鐘，采用MALDI-TOF定性和HPLC定量；

2）在包含N-X-S/T序列的蛋白hmw1ct(NCBI:Accession:WP_014550671.1GI: 504363569,AtaC1866–2428)進行糖基化修飾，反應體系為200ul，包含pH=8.0Tris-HCl (50mM),MgCl₂(5mM),UDP-Glc(5mM),NaCl(100mM),ApNGT(0.3mg/ml),Protein(1mg/ml), 37℃反應一個小時，使用MALDI-TOF定性。

本發明進一步公開了胸膜肺炎放線桿菌ApNGT基因在制備提高糖基化多肽的效率 方面的應用。實驗結果表明：本發明提供的胸膜肺炎放線桿菌ApNGT基因（改造型酶），可以 大量提高糖基化多肽的效率，可以實現體外多肽糖基化，通過綠色環保，簡易的操作可以大 量獲得糖基化多肽，突破了現有化學方法合成糖肽步驟繁多，成本高昂，選擇性差的屏障。 同時突變的ApNGT在大腸桿菌中表達后，在多肽水平上糖基化效率與野生型的ApNGT相比提 高了160多倍，這為多肽類和蛋白類生物制品糖基化修飾提供了極大便利。突變后ApNGT穩 定性良好，可作為一種工具酶易于商品化生產，具有廣泛的應用前景。