[發(fā)明專利]用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610010548.3
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105754882A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮明光;史漢強(qiáng);童森淼
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域的DNA重組技術(shù)和應(yīng)用，具體涉及一種用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生防真菌的遺傳改良中，是提高真菌生物防治潛能的殺手锏。一是通過對抗逆相關(guān)基因功能的研究分析，有目的地高表達(dá)內(nèi)源抗逆基因或?qū)胪庠纯鼓婊颍蕴岣呔甑目鼓媪Γ缈寡趸⒛透邼B、耐高溫、耐紫外輻射、抗殺菌劑、抗除草劑的能力。二是基于生防真菌一般經(jīng)昆蟲體壁侵染寄主的方式，將內(nèi)源或外源殺蟲蛋白基因?qū)肷勒婢蚪M中高表達(dá)，以拓寬菌株的殺蟲譜或提高菌株對靶標(biāo)害蟲的毒力，或使真菌獲得天生不具有的胃毒殺蟲活性。然而，目前生防真菌基因工程中所用的篩選標(biāo)記，僅限于除草劑草丁膦的抗性基因bar或氯嘧磺隆抗性基因sur，沒有更多的選擇。這些抗性標(biāo)記雖然在真菌轉(zhuǎn)化中是有效的，但所構(gòu)建的工程菌除了表達(dá)靶標(biāo)基因之外，也同時表達(dá)外源抗性標(biāo)記基因，因而成為環(huán)境安全隱患的來源，由此增加了用于田間害蟲防治的工程菌劑通過環(huán)境安全性評估的難度。

構(gòu)建環(huán)境安全低風(fēng)險的生防真菌工程菌，不僅要求被導(dǎo)入的靶標(biāo)基因是環(huán)境安全的，而且要求用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因也是環(huán)境安全的。在生防真菌中一些引起特定營養(yǎng)缺陷型的基因，具有作為內(nèi)源性安全篩選標(biāo)記的潛力，但鮮見用于研究實(shí)踐，以致于目前用于轉(zhuǎn)化標(biāo)記的基因都是外源的除草劑抗性基因。其它真菌轉(zhuǎn)化中常用的潮霉素等抗生素標(biāo)記，無一可用于生防真菌的轉(zhuǎn)化。在球孢白僵菌功能基因的鑒定中，我們發(fā)現(xiàn)乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶基因ura3的缺失能導(dǎo)致脲嘧啶營養(yǎng)缺陷型，而添加外源脲嘧啶可使ura3缺失株恢復(fù)正常生長，因而可用于白僵菌轉(zhuǎn)化的新型安全篩選標(biāo)記。這是因?yàn)閡ra3可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)尿嘧啶合成，其功能缺失使尿嘧啶合成受阻，因而無法正常生長。在以改良生防性狀為目標(biāo)的被整合靶標(biāo)蛋白中，Vip3A是蘇云金芽孢桿菌在營養(yǎng)生長期分泌的一類昆蟲中腸特異性胃毒殺蟲蛋白，其家族成員對鱗翅目害蟲具有較廣譜的殺蟲活性，且對人畜安全無害。表達(dá)Vip3A蛋白抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉花已在美國獲準(zhǔn)田間釋放。本實(shí)驗(yàn)室先前使用bar標(biāo)記基因成功地將Vip3Aa1(Vip3A家族的代表之一)基因轉(zhuǎn)入白僵菌和綠僵菌中表達(dá)，使工程菌獲得了野生株不具有的特異性胃毒殺蟲活性，高表達(dá)Vip3Aa1的工程菌劑對田間甘藍(lán)上多種害蟲的防效可匹敵化學(xué)殺蟲劑。

轉(zhuǎn)基因工程菌劑的注冊必須通過嚴(yán)苛的環(huán)境安全評估。為了降低其安全風(fēng)險，發(fā)明人嘗試?yán)脙?nèi)源的脲嘧啶營養(yǎng)缺陷型基因ura3作為安全篩選標(biāo)記，將Vip3Aa1導(dǎo)入球孢白僵菌中表達(dá)，并與先前的工程菌株比較目標(biāo)基因和蛋白的表達(dá)水平，以構(gòu)建更為安全的轉(zhuǎn)基因工程菌技術(shù)平臺。由于ura3源于白僵菌本身，這一技術(shù)實(shí)為無外源標(biāo)記的基因操作技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是找到并提供一種內(nèi)源安全標(biāo)記，能表達(dá)昆蟲胃毒殺蟲蛋白，賦予生防真菌不具有的胃毒侵染殺蟲機(jī)制和殺蟲活性顯著增強(qiáng)的殺蟲蛋白超高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因工程菌株構(gòu)建方法，并獲得相應(yīng)的工程菌株。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用內(nèi)源ura3基因作為安全標(biāo)記構(gòu)建高表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌BbHUV5，該工程菌株的保藏名稱為：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2015年12月02日；保藏編號：CGMCCNo.11802。

所述的用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟：

（1）載體構(gòu)建

根據(jù)目標(biāo)基因vip3Aa1的ORF及其載體的序列確定合適的酶切體系，分別提取pAN52-Phydl-tl-Vip3A和p0380-ura3質(zhì)粒，經(jīng)XbaI和HindIII雙酶切，回收正確酶切片段并通過T4連接酶連接而成新質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR鑒定、酶切鑒定，獲得陽性大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株。然后擴(kuò)增ura3的ORF并測序確認(rèn)，選取正確轉(zhuǎn)化子即為新載體pAN52-Phydl-tl-vip3Aa1-ura3；

（2）ura3缺失株感受態(tài)芽孢子轉(zhuǎn)化與篩選

將所構(gòu)建的雙元質(zhì)粒經(jīng)HindIII酶切線性化，再用PEG和LiAc介導(dǎo)的ura3缺失株芽生孢子轉(zhuǎn)化體系將其轉(zhuǎn)化到其基因組中，篩選出陽性克隆，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子中vip3Aa1基因的轉(zhuǎn)錄水平分析；

（3）獲得內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程菌株