[發(fā)明專利]用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610010548.3
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105754882A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮明光;史漢強(qiáng);童森淼
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

1.用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌，其特征是：菌株BbHUV5的保藏名稱為：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2015年12月02日，保藏編號：CGMCCNo.11802。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟：

（1）載體構(gòu)建

根據(jù)目標(biāo)基因開放閱讀框(ORF)及其載體的序列確定合適的酶切體系，分別提取pAN52-Phydl-tl-Vip3A和p0380-ura3質(zhì)粒，經(jīng)XbaI和HindIII雙酶切，回收正確酶切片段并通過T4連接酶連接而成新質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR鑒定、酶切鑒定，獲得陽性大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株，然后，擴(kuò)增ura3的ORF并測序確認(rèn)，選取正確轉(zhuǎn)化子即為新載體pAN52-Phydl-tl-vip3Aa1-ura3；

（2）ura3缺失株感受態(tài)芽孢子轉(zhuǎn)化與篩選

將所構(gòu)建的雙元質(zhì)粒經(jīng)HindIII酶切線性化，再用PEG和LiAc介導(dǎo)的ura3缺失株經(jīng)芽生孢子轉(zhuǎn)化體系將其轉(zhuǎn)化到其基因組中，篩選出陽性克隆，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子中vip3Aa1基因的轉(zhuǎn)錄水平分析；

（3）獲得內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)昆蟲胃毒蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程菌株

篩選轉(zhuǎn)錄水平最高的轉(zhuǎn)化子，以BbV28作為對照，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定即ELISA實驗，以檢測Vip3Aa1蛋白在轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)水平，獲得內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)昆蟲胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程菌株BbHUV5，保藏編號為CGMCCNo.11802。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)昆蟲胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌的構(gòu)建方法，其特征是：所述步驟（3）中的生防真菌為球孢白僵菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用內(nèi)源安全標(biāo)記表達(dá)胃毒殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因生防工程真菌的用途，其特征是：用于胃毒殺蟲，不需要外源標(biāo)記，避免了原先除草劑標(biāo)記下工程菌株的環(huán)境風(fēng)險。