[發明專利]用內源安全標記表達胃毒殺蟲蛋白的轉基因生防工程真菌及其構建方法

在審

• 申請號: 201610010548.3
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105754882A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 馮明光;史漢強;童森淼
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

1.用內源安全標記表達胃毒殺蟲蛋白的轉基因生防工程真菌，其特征是：菌株BbHUV5的保藏名稱為：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期：2015年12月02日，保藏編號：CGMCCNo.11802。

2.根據權利要求1所述的用內源安全標記表達胃毒殺蟲蛋白的轉基因生防工程真菌的構建方法，其特征是包括以下步驟：

（1）載體構建

根據目標基因開放閱讀框(ORF)及其載體的序列確定合適的酶切體系，分別提取pAN52-Phydl-tl-Vip3A和p0380-ura3質粒，經XbaI和HindIII雙酶切，回收正確酶切片段并通過T4連接酶連接而成新質粒，經轉化、PCR鑒定、酶切鑒定，獲得陽性大腸桿菌轉化菌株，然后，擴增ura3的ORF并測序確認，選取正確轉化子即為新載體pAN52-Phydl-tl-vip3Aa1-ura3；

（2）ura3缺失株感受態芽孢子轉化與篩選

將所構建的雙元質粒經HindIII酶切線性化，再用PEG和LiAc介導的ura3缺失株經芽生孢子轉化體系將其轉化到其基因組中，篩選出陽性克隆，進行轉化子中vip3Aa1基因的轉錄水平分析；

（3）獲得內源安全標記表達昆蟲胃毒蛋白的轉基因生防工程菌株

篩選轉錄水平最高的轉化子，以BbV28作為對照，進行酶聯免疫吸附測定即ELISA實驗，以檢測Vip3Aa1蛋白在轉化子中的表達水平，獲得內源安全標記表達昆蟲胃毒殺蟲蛋白的轉基因生防工程菌株BbHUV5，保藏編號為CGMCCNo.11802。

3.根據權利要求2所述的用內源安全標記表達昆蟲胃毒殺蟲蛋白的轉基因生防工程真菌的構建方法，其特征是：所述步驟（3）中的生防真菌為球孢白僵菌。

4.根據權利要求1所述的用內源安全標記表達胃毒殺蟲蛋白的轉基因生防工程真菌的用途，其特征是：用于胃毒殺蟲，不需要外源標記，避免了原先除草劑標記下工程菌株的環境風險。