[發明專利]轉基因玉米IE034外源插入片段3’端旁側序列及檢測方法

有效

• 申請號: 201610009212.5
• 申請日: 2016-01-07
• 公開（公告）號: CN105543238B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 杜智欣;付偉;魏霜;乾義柯;王晨光;朱鵬宇;王國英;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明提供轉基因玉米事件IE034插入位點的外源插入片段的3'端旁側序列及其應用。本發明還提供了用于檢測該旁側序列的引物、探針和試劑盒。本發明所提供的旁側序列和引物適用于快速檢測樣品是否含有轉基因玉米品系IE034，為轉基因安全提供保障。

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種轉基因玉米IE034 外源插入片段3'端旁側序列及定性PCR檢測方法，以及用于檢測該序列的PCR引物、探針和試劑盒。

背景技術

玉米作為我國三大糧食作物之一，播種面積和總產量均居第二位，在我國糧食安全中發揮著重要的作用。近年來，國內玉米種植面積保持在5億畝以上，同時，每年還要進口300萬-500萬噸的轉基因玉米彌補消費缺口。而隨著飼用玉米需求的剛性增長和近年來玉米深加工業的快速發展，國內玉米消費還將持續增長。但是病蟲害、雜草、干旱、鹽堿等生物或非生物脅迫嚴重影響了玉米生產。培育具有抗蟲、抗除草劑、抗病等性狀的轉基因玉米品種并應用到實際生產中，能夠減少玉米產量損失，減少農藥化肥使用量。其中Bt蛋白的發現揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt殺蟲蛋白基因來源于蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis即Bt桿菌)，是天然存在于土壤中的格蘭氏陽性菌，在其芽孢形成過程中產生許多以結晶方式存在的蛋白質，這些蛋白質具有殺蟲活性，通常也被稱為Bt殺蟲蛋白。Bt殺蟲蛋白按氨基酸序列的同源性可分為45大類313種，Cry1Ie抗蟲基因屬于BT殺蟲蛋白家族，是中國農業科學院植物保護研究所首次分離克隆出來的一種新的Cry基因，隨后中國農業科學院作物科學研究所將Cry1Ie基因通過農桿菌介導法轉入到了中國玉米優良自交系綜31基因組中，獲得了一個抗蟲轉基因玉米事件IE034，現已在進行環境釋放階段的安全評價，對于未來國內日益高漲的玉米需求，該抗蟲玉米有可能進入商業化種植并推廣。

轉基因玉米IE034已申請“農業轉基因生物安全評價證書”，因而其分子特征，包括插入序列、插入位點及其相應的檢測方法都需要非常清晰，其中中國專利201210065919.X提供了轉基因玉米事件 IE034插入位點的外源5'端旁側DNA序列，該序列全長312bp。但目前尚不清楚轉基因玉米事件IE034插入位點的外源3'端旁側DNA 序列，關鍵原因是3'端旁側序列結構更為復雜，受體基因組序列和載體序列間或出現，需要更精準的實驗進行鑒定。因此3'端旁側DNA 序列及鑒定方法是轉基因玉米IE034安全管理不可或缺的部分。

發明內容

本發明的目的是提供轉基因玉米事件IE034插入位點的外源插入片段的3'端旁側DNA序列及其應用，以及用于檢測該序列的PCR引物、探針和試劑盒。

為達到以上目的，本發明提供了轉基因玉米IE034外源插入片段 3'端旁側DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者為SEQ ID NO.1所示序列的特異性片段。

本發明還提供了所述DNA序列在檢測轉基因玉米中的應用。

本發明還提供了用于檢測權利要求1所述的DNA的特異性PCR 檢測引物及探針，所述引物的核苷酸序列為：

上游引物：5'-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3'，

下游引物：5'-TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3'；

探針為：5'-F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3'。

可選的，在所述探針中，F為FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、 Cy3或Cy5；Q為Tamra、Rox、Dabcy、Bhq1或Bhq2。

本發明還提供了一種轉基因玉米IE034的檢測試劑盒，所述試劑盒含有特異性PCR檢測引物及探針，所述引物的核苷酸序列為：

上游引物：5'-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3'，