[發明專利]一種基于復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201610008360.5
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105602992B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 祁偉;俞磊;余宙
• 申請（專利權）人: 上海優卡迪生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

本發明公開了一種基于復制缺陷性重組慢病毒的CAR?T轉基因載體，包括：用于質粒復制的原核復制子pUC Ori序列；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列；用于增強真核細胞內的復制的病毒復制子SV40 Ori序列；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白；用于共同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子；用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件。此外，還公開了該載體的構建方法和應用。本發明能顯著提高細胞因子的分泌、CAR?T細胞的體外殺傷作用，且臨床治療效果突出。

技術領域

本發明屬于醫學生物領域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種基于復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體。此外，本發明還涉及該載體的構建方法和應用。

背景技術

腫瘤免疫治療的理論基礎是免疫系統具有識別腫瘤相關抗原、調控機體攻擊腫瘤細胞(高度特異性的細胞溶解)的能力。這個生物過程十分復雜，目前仍處于研究之中。上世紀90年代，多個科研小組已發現了腫瘤抗原(tμmor antigens)，T淋巴細胞可通過主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)依賴性方式識別這些腫瘤抗原。

腫瘤免疫治療通常分為兩類，非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫治療主要包括白細胞介素-2(interleμkin-2，IL-2)，干擾素α(interferonα，IFN-α)，腫瘤壞死因子(tμmor necrosis factor，TNF-α)，卡介苗等細胞因子和毒素，過繼性細胞免疫治療等。特異性免疫治療主要是腫瘤疫苗。

1.1腫瘤非特異性免疫治療

非特異性免疫應答是與生俱來的，它的形成并不需要抗原刺激，能廣泛地針對多種抗原，是免疫應答的基礎，但特異性不強，對某種特定抗原物質往往不能產生足夠強度的反應非特異性的免疫治療。在進入臨床試驗的多種細胞因子中，白細胞介素-2和干擾素應用最為廣泛[Rosenberg S A，Lotze M T，Mμμl L M，et al.A progress report on thetreatment of 157patients with advanced cancerμsing lymphokine-activatedkiller cells and interleμkin-2or high-dose interleμkin-2alone[J].N Engl JMed，1987，316(15):889－897.]。

1.2腫瘤單克隆抗體的免疫治療

近20多年來單克隆抗體已在腫瘤治療領域得到廣泛應用。抗腫瘤單抗藥物一般包括兩類：一是抗腫瘤單抗，二是抗腫瘤單抗偶聯物，或稱免疫偶聯物。免疫偶聯物分子由單抗與“彈頭”藥物兩部分組成，“彈頭”主要包括放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接后分別構成放射免疫偶聯物、化學免疫偶聯物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美國FDA分別通過了用于臨床腫瘤治療的兩個單抗—Ritμximab(ritμxan)和Trastμzμmab(herceptin)[Dillman R O.Magic bμllets at last！Finally—approval of amonoclonal antibody for the treatment of cancer[J].Cancer Biother Radiopharm，1997，12:223－225.]。目前認為單抗的作用機制有阻斷作用、信號傳導作用以及靶向作用等三種作用機制，沒有直接的殺傷作用。另外還存在藥理學方面的問題，主要是到達腫瘤的藥量不足。由于偶聯物是異體蛋白，會被網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚于肝、脾和骨髓。偶聯物是大分子物質，通過毛細血管內皮層及穿透腫瘤細胞外間隙均受到限制。

1.3腫瘤的過繼免疫治療