[發(fā)明專利]一種基于復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體及其構建方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610008360.5
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105602992B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發(fā)明（設計）人: 祁偉;俞磊;余宙
• 申請（專利權）人: 上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 上海市匯業(yè)律師事務所 31325
• 代理人: 王函

1.一種基于復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體，其特征在于，包括：用于質粒復制的原核復制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于增強真核細胞內的復制的病毒復制子SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白，如SEQIDNO.11所示；用于共同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列，如SEQIDNO.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子，如SEQIDNO.14所示；用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件，如SEQIDNO.13所示。

2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受體信號肽、如SEQIDNO.20所示的CD19VL、如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.16所示的CD19單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28、如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域。

3.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受體信號肽、如SEQIDNO.20所示的CD19VL、如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.16所示的CD19單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28、如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域、以及如SEQIDNO.25所示的CD28嵌合受體共刺激因子。

4.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag順式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE順式元件、如SEQIDNO.9所示的env順式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT順式元件。

5.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag順式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE順式元件、如SEQIDNO.9所示的env順式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT順式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV啟動子。

6.如權利要求1-5任一項所述的載體，其特征在于，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。