[發(fā)明專利]小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610005851.4
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105567659A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設計）人: 聶紅明;汪蓉;王學斌;陳建杰;高月求;梅昭荷;申弘
• 申請（專利權）人: 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)及其應用。

背景技術

蛋白質的降解主要通過兩種途徑：溶酶體降解途徑和泛素介導的蛋白酶體降解途徑。溶酶體降解途徑是一個非選擇的蛋白質降解途徑，主要降解通過攝粒作用或胞飲作用進入細胞內的外源蛋白質；而泛素介導的途徑是一個受到嚴格的時空調控的特異性蛋白質降解途徑，被降解的蛋白通過E1(泛素激活酶，Ubiquitin-activatingenzyme)、E2(泛素偶聯酶，Ubiquitin-conjungatingenzyme)和E3(泛素連接酶，Ubiquitinligase)一系列的作用與多個泛素共價結合后被蛋白酶復合體(Proteasome)識別并降解。此為生物大分子在胞質中降解的泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitimproteosomepathway)。該途徑廣泛參與到細胞周期、炎癥反應、細胞凋亡、抗原提呈等許多生命過程中。

Nrdp1(neuregulinreceptordegradationprotein-1)是一種E3泛素連接酶。Nrdp1能雙向調節(jié)TLR介導的兩條信號通路(降解MyD88抗炎，激活TRIF和TBK1促生干擾素)，最終介導抗炎和抗病毒的雙重效應。過表達Nrdp1可以抑制脂多糖(LPS)誘導的炎性因子IL-6和TNFα的mRNA和蛋白的表達，但是可以促進I型干擾素(IFN-β)的產生；干擾Nrdp1則促進了炎性細胞因子的產生，但是抑制了IFN-β的產生。進一步發(fā)現Nrdp1可以促進MyD88和TBK1分子的泛素化，誘導MyD88的降解，但是促進TBK1的活化，從而抑制MyD88依賴的NF-κB的活化，引起炎性細胞因子的產生減少；同時促進IRF3的磷酸化，增加I型IFN的產生。進一步的驗證表明，Nrdp1和E3泛素酶活性缺失的轉基因小鼠的巨噬細胞受到TLR配體刺激后，促進MyD88依賴的前炎性因子的產生，但抑制TRIF依賴的IFN-β的產生。因此，Nrdp1在TLR的信號傳導過程中發(fā)揮―雙向‖調節(jié)機制，一方面通過降解MyD88抑制TLR誘導的炎癥因子的產生，另一方面通過促進TBK1-IRF3的活化促進I型干擾素的產生，為TLR的分子調節(jié)機制研究提供了新的思路。因此，Nrdp1是一個可能在各種病原體感染的治療中均具有潛在應用價值的藥物靶標，在抗炎和抗病毒感染方面前景廣闊。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)，以實現對小鼠NRDP1基因的定點修飾。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)在哺乳動物細胞或胚胎NRDP1基因修飾中的應用。

本發(fā)明的還一目的在于提供一種NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的實施方式首先提供了一種小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)，該基因定點修飾系統(tǒng)為剪切小鼠NRDP1基因靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs。其中，上述小鼠NRDP1基因靶序列如SEQIDNO.1所示，具體來說，在SEQIDNO.1序列中：20～40位核苷酸為識別模塊TALNRD-2F、與57～74位核苷酸的互補序列為識別模塊TALNRD-2R、40～56核苷酸為間隔序列。上述轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由識別上述識別模塊TALNRD-2F的核酸酶TALEN-L和識別上述識別模塊TALNRD-2R的核酸酶TALEN-R組成；核酸酶TALEN-L為SEQIDNO.2所示核苷酸序列編碼的蛋白質，核酸酶TALEN-R為SEQIDNO.3所示核苷酸序列編碼的蛋白質。

進一步地，在本發(fā)明的實施方式所提供的小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)中，核酸酶TALEN-L由所述識別模塊TALNRD-2F的識別結構域TALEN-L與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-I融合而成；所述核酸酶TALEN-R由所述識別模塊TALNRD-2R的識別結構域TALEN-R與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-I融合而成。

本發(fā)明的實施方式還提供上述小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)在哺乳動物細胞或胚胎NRDP1基因修飾中的應用。

具體來說，本發(fā)明的實施方式所提供的上述小鼠NRDP1基因定點修飾系統(tǒng)在哺乳動物細胞或胚胎NRDP1基因修飾中的應用，是指建立NRDP1基因敲除小鼠模型。